Messung des neurotoxischen Potentials und der Organverteilung Makrozyklischer Laktone in mdr1-defizienten Mäusen

Abstract

Die Makrozyklischen Laktone (ML), zu unterscheiden in Avermectine (z.B. Ivermectin (IVM), Selamectin und Doramectin) und Milbemycine (z.B. Moxidectin (MOX), Milbemycinoxim (MIL)), stellen in der Veterinärmedizin häufig gebrauchte Antiparasitika dar. Im Parasiten führen sie durch die Öffnung von Glutamat- und GABA-gesteuerten Chloridkanälen zu einer schlaffen Paralyse. Die Anwendung ist beim Säuger dagegen durch die Barrierefunktion der Blut-Hirn-Schranke (BHS), an der P-Glycoprotein (Pgp) als Efflux-Transporter die ML unter ATP-Verbrauch aus dem ZNS zurück in das Blutkompartiment pumpt, sehr sicher. Allerdings zeigen insbesondere Hunde der Rasse Collie häufig Vergiftungssymptome nach der Gabe von IVM. Ursache dafür ist eine 4 Basenpaar-Deletion im MDR1-Gen des Hundes (nt230(del4)), welche zu einer unvollständigen Translation des Proteins führt. In gezielt durchgeführten Studien zeigte sich, dass die neurotoxische Wirkung je nach eingesetzter Substanz sehr differierte. So wurde die Gabe von 1 mg/kg MOX von MDR1-defekten Collies gut toleriert, während IVM in der gleichen Dosierung schon Vergiftungsanzeichen hervorrief.Ziel dieser Arbeit war es, die Gehirnkonzentrationen bei fehlendem Pgp für IVM, MOX und MIL zu ermitteln und deren Neurotoxizität zu messen, um eine Aussage über das unterschiedliche neurotoxische Potenzial der einzelnen ML treffen zu können. Als Tiermodell standen Mäuse der CF-1-Linie, die eine natürliche Mutation im mdr1a-Gen aufweisen, sowie mdr1a,b-Doppelknockout Mäuse zur Verfügung. Bei fehlendem Pgp penetrieren IVM und MOX nach Applikation von 0,2 mg/kg vergleichbar in das ZNS, MIL dagegen nur zu 20%. Vergleichbare Werte erreichte man für MIL erst nach Applikation der therapeutischen Dosierung von 2,5 mg/kg. Bei den Applikationsstudien an Wildtyp Mäusen mit intakter BHS stellte sich heraus, dass IVM die geringsten, MOX mittlere und MIL die höchsten Gehirnkonzentrationen aufweist. Somit hat IVM die höchste und MIL die geringste Affinität zu Pgp. Die Neurotoxizität wurde mit Hilfe eines neuen Rotarod-Setups gemessen und verglichen. Es zeigte sich, dass eine höhere Dosierung von MOX (0,7 mg/kg) und MIL (40 mg/kg) als von IVM (0,35 mg/kg) benötigt wird, um eine vergleichbare Beeinträchtigung der Laufperformance auf dem Rotarod zu erreichen. Verantwortlich dafür ist vermutlich die unterschiedliche Interaktion der einzelnen ML mit dem GABAA-Rezeptor. In weiteren Untersuchungen muss geklärt werden, ob dafür eine unterschiedliche Affinität oder die intrinsische Aktivität an dem Rezeptor verantwortlich ist. In veterinary medicine macrocyclic lactones (ML), to be differentiated in avermectines (eg ivermectin (IVM), selamectin and doramectin) and milbemycines (eg moxidectin (MOX), milbemycinoxime (MIL)), are commonly used anti-parasitic drugs. In parasites they lead to a flaccid paralysis due to the opening of glutamate- and GABA-gated chloride ion channels. In contrast, the ML have a wide margin of safety in mammals at therapeutic dosage. At the blood-brain barrier (BBB) P-glycoprotein (Pgp), an ATP-driven efflux pump, is highly expressed and therefore restricts the ML-entry into the central nervous system (CNS). However, in many dog breeds such as the Collie signs of neurotoxicosis appeared after application of IVM. Responsible for this intolerance is a 4 base pair deletion in the MDR1 gene of the dog (nt230(del4)), which results in an incomplete translation and the expression of a non-functional Pgp. Studies showed that the neurotoxic effect varied depending on the substance applied. The administration of 1 mg / kg MOX was well tolerated, whereas IVM had caused poisoning signs at the same dose.The aim of this work was to determine the brain concentrations in the absence of Pgp for IVM, MOX and MIL and to measure their neurotoxicity in order to make a conclusion about the different neurotoxic potential of each ML. Mice of the CF-1 line, which have a natural mutation in the mdr1a gene, as well as mdr1a,b-double knockout mice were used. In the absence of Pgp, IVM and MOX comparably penetrate into the CNS after administration of 0.2 mg/kg, MIL only to 20%. Comparable penetration values for MIL are reached after application of the therapeutic dose of 2.5 mg/kg. In the wildtype mice with an intact BBB, application studies showed that IVM has the lowest, MOX some more and MIL the highest brain concentrations. Thus, it seems that IVM has the highest and MIL the lowest affinity for Pgp. Neurotoxicity was measured and compared using a newly designed rotarod setup. It was found that higher doses of MOX (0.7 mg/kg) and MIL (40 mg/kg) are required as of IVM (0.35 mg/kg) to reach a similar impairment of the running performance on the rotarod. This seems to be due to the different interaction of each ML with the GABAA receptor. Further studies are needed to find out whether a different affinity or the intrinsic activity to the receptor are responsible for this difference.