Molekulargenetische und zytogenetische Charakterisierung eines Hypopigmentierungssyndroms beim Kamerunschaf

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, auf molekular- und zytogenetischer Ebene, die Ursache für das Auftreten eines mit Hypopigmentierung assoziierten Letalfaktors in einer Kamerunschafherde aufzuklären. Die insgesamt 5 betroffenen Lämmer wurden fast weiß geboren, zeigten nach relativ kurzer Zeit Anzeichen intestinaler Obstruktion und starben wenig später. Zwei dieser Lämmer standen für eine Obduktion zur Verfügung. Diese ergab eine beträchtliche Dilatation des Cecums, außerdem befand sich noch Mekonium im Enddarm. Die histopathologische Untersuchung von Proben aus verschiedenen Darmabschnitten zeigte morphologisch normale Ganglienzellen in ausreichender Anzahl und Verteilung.DNA-Proben von 2 Merkmalsträgern und von mit ihnen verwandten und nicht verwandten Tieren aus der betroffenen Herde, wurden molekulargenetisch auf Mutationen im Kandidatengen EDNRB untersucht. Die PCR-Amplifikation der codierenden Bereiche des Gens ergab zunächst, dass bei den beiden Merkmalsträgern offensichtlich entsprechende Bindungsstellen für die verwendeten Primer fehlten, während bei allen anderen Herdenmitgliedern alle codierenden Bereiche mittels PCR erfolgreich amplifiziert werden konnten. Weitere Analysen der flankierenden Sequenzbereiche des Gens ergaben, dass die Merkmalsträger homozygot für eine 110 kb große Deletion auf dem Chromosom 10 sind, die das gesamte EDNRB-Gen mit einschließt. Für die vorliegende Mutation wurde weiterhin ein Gentest auf Basis einer Duplex-PCR entwickelt, der es erlaubt, anlagefreie Tiere von Anlageträgern sicher zu differenzieren. Die Analyse aller Proben mit diesem Test ergab, dass alle Mutterschafe, die einen Merkmalsträger geboren hatten, heterozygot für die Deletion waren. Insgesamt war fast die Hälfte der Schafe aus der betroffenen Herde Anlageträger der Mutation. Mit dem Gentest wurden 127 weitere Kamerunschafe aus insgesamt 7 Herden auf das Vorhandensein der Mutation getestet. Dabei konnten keine weiteren Anlageträger der Mutation identifiziert werden, so dass man davon ausgehen kann, dass sich der Defekt auf die betroffene Familie beschränkt und nicht weiter in der Kamerunpopulation verbreitet wurde.Auch auf zytogenetischer Ebene konnten die Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung bestätigt werden.Mutationen im EDNRB-Gen sind bereits bei verschiedenen anderen Spezies im Zusammenhang mit dem Auftreten von Hypopigmentierungssyndromen beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte ein derartiger genetischer Defekt zum ersten Mal bei einer Nutztierspezies, dem Schaf, beschrieben und sowohl molekulargenetisch als auch zytogenetisch aufgeklärt werden. The aim of this study was to characterize from a molecular- and cytogenetic point of view the cause of the incidence of a hypopigmentation associated, lethal disease occurring in a flock of Cameroon sheep. Altogether 5 affected lambs were born showing a hypopigmented phenotype and signs of intestinal obstruction. The lambs died within a short time after birth. Two lambs were available for post mortem examination and showed a notable dilated cecum and remaining meconium. Histopathological examination of intestinal samples showed morphologically normal ganglion cells in appropriate number and distribution. DNA samples of the 2 affected lambs, relatives, and unrelated control sheep were used to screen the candidate gene EDNRB for mutations. PCR amplification of the coding areas of the gene revealed that in the affected animals the complementary primer binding sites were missing. Despite of this, all tested EDNRB fragments were successfully amplified, using DNA samples of unaffected flock mates. Further analyses of the flanking sequences of the EDNRB showed that the affected lambs were homozygous carriers of a 110 bp deletion on chromosome 10, including the entire EDNRB gene. A duplex PCR was established as a reliable test to recognize carriers of the mutation and to distinguish between heterozygous carriers and non-affected animals. The duplex PCR test elicited that the affected lambs were homozygous for the mutation, while all ewes that had born an affected lamb were heterozygous. Altogether, almost half of the animals in the affected flock were heterozygous carriers of the mutation. Using the duplex PCR, 127 additional Cameroon sheep were tested in 7 different flocks. No additional carriers of the mutation were identified. Due to these findings, it seems obvious that the incidence of the mutation is restricted to a single affected family. Hence, it can be assumed that the mutation was not widespread in the Cameroon sheep population.The results of the moleculargenetic analyses were also confirmed from a cytogenetic point of view, using fluorescence in situ hybridization. Mutations in EDNRB have been described in other species in context to the occurrence of hypopigmentation syndromes. This is the first described case of a hypopigmentation syndrome in sheep and in farm animals in general, which was clarified from a moleculargenetic and cytogenetic point of view.