Charakterisierung der Mechanosensitivität des CFTR Cl- Kanals

Abstract

Der cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ist ein Cl -leitender Ionenkanal in der apikalen Membran verschiedener Epithelien des menschlichen Körpers. Eine Vielzahl von CFTR-exprimierenden Geweben, wie z.B. Lunge, Darm, sind dauerhaft in Bewegung und somit mechanischen Kräften, wie Scherkraft (SK) und Dehnung ausgesetzt. In der Lunge resultieren aus den Atembewegungen mechanischen Kräfte. Es gibt erste Hinweise darauf, dass die Aktivität des CFTR durch mechanische Stimuli reguliert werden kann. Darüber hinaus ist aus Studien anderer mechanosensitiver Ionenkanäle bekannt, dass sowohl die Membranzusammensetzung als auch die Verbindungen mit dem Zytoskelett an der Wahrnehmung und Weiterleitung mechanischer Kräfte beteiligt sein können. Basierend auf diesen Hinweisen waren die Ziele der vorliegenden Arbeit: 1) die Untersuchung von SK und/oder Dehnung als adäquater mechanischer Stimulus der Regulation der CFTR-Aktivität, 2) die Verifizierung der mechanosensitiven CFTR-Aktivierung in einem nativen Epithel sowie 3) die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen einer mechanosensitiven CFTR-Aktivierung.Ziel 1) Der humane CFTR (hCFTR) wurde heterolog in Oozyten des Afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert und die Aktivität des hCFTR wurde durch Forskolin und IBMX (F/I) induziert und mittels der two-electrode voltage-clamp (TEVC)-Technik bestimmt. Es wurde kein Einfluss von SK, in einer physiologisch relevanten Größenordnung (1,3 dyn/cm2), auf die Aktivität des hCFTR nachgewiesen. Über die Erhöhung des Oozytenvolumens durch osmotische Zellschwellung oder durch Injektion einer intrazellulär-analogen Lösung erfolgte die Membrandehnung, wodurch sich die F/I-induzierte hCFTR-Aktivierung erhöhte. Wurde der hCFTR mit F/I vorstimuliert, erhöhte sich die hCFTR-Aktivität unmittelbar durch den Dehnungsstimulus. Dieser Effekt konnte durch den hCFTR Blocker CFTRinh-172 inhibiert werden. Die Dehnungs-induzierte Aktivierung konnte zudem auch bei den zwei häufigen CFTR-Mutationen, delF508 und G551D, nachgewiesen werden und war unverändert im Vergleich zum Wildtyp hCFTR.Ziel 2) Um die Dehnungs-sensitive CFTR-Aktivität in einem nativen pulmonalen Epithel zu untersuchen, wurden Ussing-Kammer-Experimente mit Lungenpräparaten von Xenopus durchgeführt. Die Dehnung des Epithels wurde durch eine Erhöhung des hydrostatischen Drucks (HD; 5 cm und 10 cm Flüssigkeitssäule) induziert. Unter Kontrollbedingungen resultierte die Applikation von HD in einem Stromabfall und in einer Aktivierung der Cl -Sekretion. In Anwesenheit des CFTR-Inhibitors GlyH-101 war der HD-induzierte Stromabfall vergrößert, was die Dehnungs-sensitive Aktivierung des CFTR unter Kontrollbedingungen bestätigt.Ziel 3) Um zu überprüfen, ob die Membranfluidität an der Mechanosensitivität des hCFTR beteiligt ist, wurde die Membranfluidität von hCFTR-exprimierenden Oozyten pharmakologisch erhöht oder reduziert. Die Dehnungs-induzierte hCFTR-Aktivität war sowohl bei erhöhter als auch reduzierter Membranfluidität verringert im Vergleich zu unbehandelten Oozyten. Zur Überprüfung einer möglichen Beteiligung von Zytoskelettelementen an der Dehnungs-wahrnehmung des hCFTR wurden Aktinfilamente und Mikrotubuli pharmakologisch destabilisiert und stabilisiert. Während die Destabilisierung der Aktinfilamente sowie der Mikrotubuli keine Änderung der Dehnungs-induzierten hCFTR-Aktivität zur Folge hatte, führte die Stabilisierung beider Zytoskelettelemente zu einer verringerten Dehnungswahrnehmung des hCFTR. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden drei C-terminale Aminosäuren (TRL) des hCFTR deletiert, da diese einen Verknüpfungspunkt zum Zytoskelett darstellen. Die Dehnungswahrnehmung dieser delTRL hCFTR-Mutante war signifikant vermindert im Vergleich zum Wildtyp hCFTR. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Dehnung sowohl im in vitro System der Xenopus Oozyten als auch in einem nativen Lungenepithel der adäquate mechanische Stimulus für die Regulierung der CFTR-Aktivität ist. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse zum ersten Mal, dass die Membranfluidität, ein intaktes Zytoskelett und die Aktin-Bindestelle am C-Terminus des hCFTR notwendig für die Wahrnehmung des Dehnungsstimulus des hCFTR sind. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a Cl conducting ion channel, which is located in the apical membrane of various epithelia of the human body. A variety of CFTR expressing tissues are permanently in motion and thus exposed to mechanical forces. In the lung, mechanical forces including shear force (SF) and strain occur during the breathing movements. Beside known factors (e.g. ATP, protein kinases) there is preliminary evidence that mechanical forces could also represent a factor that influences CFTR activity. As known from other mechanosensitive ion channels, the membrane composition and a connection with the cytoskeleton could be involved in the detection and transmission of mechanical forces. Based on recent knowledge, and to further explore if the CFTR is a mechanosensitive channel and how it senses mechanical forces, the aims of the present doctoral thesis were: 1) to determine if SF and/or strain are adequate mechanical stimuli for regulating CFTR activity, 2) to verify mechanical activation of CFTR in a native epithelium, as well as 3) to characterise the underlying mechanisms of the mechanically-induced CFTR activation.Aim 1) The human CFTR (hCFTR) was heterologously expressed in oocytes of the African clawed frog Xenopus laevis. The activity of hCFTR was measured by the two-electrode voltage-clamp technique (TEVC) and CFTR-mediated currents were elicited by the application of forskolin and IBMX (F/I) in absence and presence of a mechanical stimulus. SF in a physiological relevant range (1.3 dyn/cm2) had no influence of hCFTR activity and seems not to be the adequate stimulus for a mechanosensitive hCFTR regulation. By contrast, membrane strain was induced by increasing the oocyte s volume either by osmotic cell swelling or by injection with an intracellular analogous solution. The strain stimulus (osmotic or injection) increased the F/I-induced hCFTR activation. Further, hCFTR activity was directly augmented by the strain stimulus (injection) after pre-stimulation with F/I and this effect could be inhibited with the CFTR blocker CFTRinh-172. The strain response in channels carrying the common mutations delF508 and G551D was similar compared to wild type CFTR. These results identified membrane strain as a regulator of hCFTR activity.Aim 2) The strain-induced CFTR activation was further assessed in Ussing chamber measurements using freshly dissected Xenopus lung preparations. Tissues were mechanically stimulated by exposure to hydrostatic pressure (HP) due to increasing the fluid column at the apical side of the chamber to either 5 cm or 10 cm. Under control conditions HP decreased the ion currents and activated a Cl secretion. Application of the CFTR inhibitor GlyH-101 augmented the HP-induced current decrease, confirming a strain-sensitive activation of CFTR under control conditions.Aim 3) To examine a possible impact of membrane fluidity in strain-sensing of hCFTR the membrane cholesterol of oocytes was pharmacologically increased or decreased. The strain-induced hCFTR activity was lowered by both strategies compared with untreated oocytes. This indicates that the membrane composition participates in sensation of strain by hCFTR.In order to investigate on a putative role of the cytoskeleton in the strain-sensing of hCFTR the actin and tubulin filaments were pharmacologically destabilized or stabilized. The destabilisation of actin filaments as well as tubulin filaments had no influence in the strain-sensing of hCFTR. By contrast, stabilization of both actin and tubulin filaments led to a decrease in the strain-sensing of hCFTR. It is known that the C-terminus of hCFTR is connected to actin cytoskeletal elements. Using site-directed mutagenesis, the three C-terminal amino acids threonine (T), arginine (R) and leucine (L) were deleted (delTRL) and this delTRL hCFTR mutant was subsequently expressed in Xenopus oocytes to compare the strain-sensing with wild type hCFTR. With this approach a significantly reduced strain-induced effect of delTRL hCFTR was detected. These results identify for the first time that the strain-sensing of hCFTR requires an intact cytoskeleton as well as the actin-binding motif at the C-terminal end of hCFTR.In conclusion, these data demonstrate activation of CFTR in vitro and in a native pulmonary epithelium in response to membrane strain. The underlying mechanisms revealed an essential role of the membrane fluidity as well as the cytoskeleton in the strain-sensing of hCFTR in the oocyte expression system.