Identifizierung und Charakterisierung vesikulärer Strukturen im caninen Ejakulat sowie Untersuchungen zu deren funktioneller Bedeutung

Abstract

Bei vielen Spezies, darunter Mensch, Bulle, Pferd und Schwein, sind vesikuläre Strukturen als Bestandteil des Ejakulats schon lange Gegenstand der Forschung. Nach Beginn dieser Arbeit wurden zwei Studien publiziert, die sich erstmals mit Vesikeln aus dem caninen Ejakulat beschäftigten. Während vor allem beim Menschen zahlreiche Funktionen der Vesikel im Rahmen der Spermienphysiologie bekannt sind und man auch bei anderen Spezies von einem bedeutenden, vesikulären Einfluss auf die Fortpflanzungsprozesse ausgeht, ist der Kenntnisstand beim Rüden sehr gering. Dieser Hintergrund war Hauptmotivation für die vorliegende Arbeit, deren Ziel es war, grundlegende Erkenntnisse über den vesikulären Aufbau zu erlangen. Darüber hinaus sollten ein möglicher, gewinnbringender Einsatz im Rahmen der Kryokonservierung der Spermienzellen und damit die vesikuläre Funktion untersucht werden. Hierfür wurden Ejakulate von 35 Rüden (31 normosperme Rüden, 2 Rüden mit Hypokinozoospermie, 1 Rüde mit Pathospermie und 1 Rüde mit Azoospermie) lichtmikroskopisch (n=35), elektronenmikroskopisch (n=18), mittels SDS-PAGE (n=14), MALDI-TOF-MS-Analyse (n=6), HPTLC mit nachfolgender Iodfärbung und Densitometrie (Bestimmung der Phospholipide, n=14) und Cholesterol-Assay-Kit (n=12) untersucht. Außerdem wurden Spermienproben von 10 normospermen Rüden ohne (Gruppe 1) oder mit (Gruppe 2) Vesikeln tiefgefroren oder nach dem Auftauen mit Vesikeln versetzt (Gruppe 3). Zu den Zeitpunkten 0, 10 und 30 Minuten nach dem Auftauen erfolgte eine spermatologische Untersuchung mittels Lichtmikroskopie, CASA, HOS-Test, Eosin-Färbung (Lebend-/Tot-Verhältnis) und Spermac®®-Färbung (Spermienmorphologie). In einem zweiten Versuchsteil wurden Spermienproben nach dem Auftauen unterschiedliche Vesikelmengen zugesetzt (0,05, 0,1 und 0,2 mg Vesikelprotein/ml) und die Ergebnisse der spermatologischen Untersuchung (0, 10 und 30 Minuten nach dem Auftauen) mittels Lichtmikroskopie und CASA verglichen. Vesicular structures in the ejaculate of many species, e. g. man, bull, horse and boar, have been subject of research for a long time. Until now, only little information about these vesicles in canine semen is available. Whereas multiple functions of human vesicles within the scope of sperm physiology are well-known, the state of knowledge with regard to the situation in dogs leaves many open questions. This background led to the present study in order to gain new insights into the canine vesicular structure und the vesicular function, especially with a view to the use of vesicles as sperm-promoting agents in cryopreservation of canine semen.Ejaculates of 35 dogs were selected (31 normospermic, 2 hypokinozoospermic dogs, 1 dog with pathospermia and 1 castrated azoospermic dog)) and investigated by means of light (LM) (n=35) and electron microscopy (EM) (n=18), SDS-PAGE (n=14), MALDI-TOF-analysis (n=6), HPTLC followed by iod staining and densitometry (for determination of phosholipids, PL) (n=14), and cholesterol assay (n=12). In order to examine the vesicular effect on sperm motility, semen of 10 healthy dogs was frozen with and without vesicles or vesicles were added after thawing. Semen evaluation after thawing was performed by means of CASA and LM, including HOS-Test, Spermac®-staining (evaluation of morphology) and Eosin-staining (proportion of living/dead spermatozoa) at 0, 10 and 30 minutes after thawing. In a second approach vesicles were added to the semen samples after thawing resulting in three groups of increasing vesicle concentrations (0,05, 0,1 and 0,2 mg protein/ml). Semen evaluation was performed by CASA and LM at 0, 10 and 30 minutes after thawing.