Funktionelle Charakterisierung des neuronal-vesikulären Carriers SLC10A4 und Etablierung eines Slc10a4-Knockout-Mausmodells

Abstract

SLC10A4 wurde im Jahre 2004 als ein neues Mitglied der SLC10-Familie identifiziert. NTCP und ASBT sind die Gründungsmitglieder der SLC10-Familie und verantwortlich für die Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislaufs der GS. SLC10A4 besitzt die höchste Sequenzidentität (29,7 %) zu dem Gallensäuretransporter der Leber, NTCP. Außerdem weist SLC10A4 eine zu NTCP, ASBT und SOAT identische Membrantopologie auf, mit sieben oder neun Transmembrandomänen und einem extrazellulären N-Terminus und zytoplasmatischen C-Terminus. Jedoch handelt es sich bei SLC10A4 um ein neuronales Protein, dessen höchste Expression im Gehirn vorliegt. Auf subzellulärer Ebene wird SLC10A4 in synaptischen Vesikeln cholinerger und monoaminerger Neurone des zentralen und peripheren Nervensystems und in Mastzellen exprimiert. Das Ziel dieser Arbeit war es die bisher unbekannte Funktion von SLC10A4 zu untersuchen. Die Zugehörigkeit zu einer Transporterfamilie und die beschriebene Lokalisation führten zu der Hypothese, dass es sich bei SLC10A4 um einen Transporter für Neurotransmitter oder deren Intermediate handeln könnte. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit, die plasmamembranständigen Neurotransmittertransporter DAT, CHT1 und SERT und die vesikulären Neurotransmittertransporter VAChT und VMAT2, als Positivkontrollen für ein funktionierendes Expressionssystem, kloniert. Nach transienter oder stabiler Transfektion in HEK293-Zellen und in Xenopus laevis Oozyten wurden Transportmessungen mit radioaktiv-markierten Kandidatensubstraten durchgeführt. Die Gallensäure TC und die Steroidsulfate DHEAS, PREGS und E1S gehören in das Substratspektrum von NTCP, jedoch nicht in das von SLC10A4. Die Neurotransmittertransporter DAT, CHT1 und SERT zeigten eine Na+-abhängige und Inhibitor-sensitive Aufnahme ihrer spezifischen Substrate und auch VMAT2 konnte in den nicht-neuronalen HEK293-Zellen charakterisiert werden. Jedoch konnte für SLC10A4 kein signifikant reproduzierbarer Transport für Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, Histamin, Cholin, Acetat, Acetylcholin, Glutamat, Aspartat und GABA gemessen werden. Die kürzlich publizierten Daten über eine Protease-aktivierbare Transportaktivität von SLC10A4 für die GS LC und TC konnte in den SLC10A4-HEK293-Zellen nicht bestätigt werden. Überraschenderweise wurde nach langen Inkubationszeiten eine verminderte ATP-Akkumulation in SLC10A4-HEK293-Zellen festgestellt. Dieses Ergebnis bedarf einer weiteren Aufklärung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein B6.129S5-Slc10a4tm1Lex Knockout-Mausmodell etabliert und erfolgreich auf den C57BL/6 Inzuchtstamm rückgekreuzt, um Hinweise auf die physiologische Rolle von SLC10A4 zu erhalten. Die Deletion des mSlc10a4-Gens wurde auf DNA-, RNA- und Proteinebene bestätigt und das Knockout-Mausmodell steht jetzt für phänotypische Untersuchungen zur Verfügung. SLC10A4 was identified in 2004 as a novel member of the solute carrier family SLC10. NTCP and ASBT are the founding members of this carrier family and are responsible for the maintenance of the enterohepatic circulation of bile acids. SLC10A4 has the highest sequence identity (29.7 %) with the bile acid transporter of the liver, NTCP. In addition, SLC10A4 exhibits an identical membrane topology to NTCP, ASBT and SOAT with seven or nine transmembrane domains and an extracellular N -terminus and a cytoplasmic C -terminus. However, SLC10A4 is a neuronal protein whose highest expression is present in the brain. At the subcellular level SLC10A4 is expressed in synaptic vesicles of cholinergic and monoaminergic neurons of the central and peripheral nervous system and in mast cells. The aim of the present study was to investigate the so far unknown function of SLC10A4.The affiliation to a transporter family and the localization described above led to the hypothesis that SLC10A4 might be a transporter for neurotransmitters or for their intermediates. Therefore, in the context of this work the plasma membrane-associated neurotransmitter transporter DAT, SERT and CHT1 and the vesicular neurotransmitter transporter VAChT and VMAT2 were additionally cloned and used as positive controls for an efficient expression system. After transient or stable transfection in HEK293 cells and in Xenopus laevis oocytes transport measurements were performed with radioactively labeled candidate substrates. The bile acid TC and the steroid sulfates DHEAS, PREGS and E1S belong to the substrate spectrum of NTCP, but not to that of SLC10A4. The neurotransmitter transporter DAT, SERT and CHT1 showed a Na+-dependent and inhibitor-sensitive uptake of their specific substrates and also VMAT2 was characterized in non-neuronal HEK293 cells. However, no significant reproducible transport of dopamine, serotonin, norepinephrine, histamine, choline, acetic acid, acetylcholine, glutamate, aspartate and GABA was detectable for SLC10A4. The recently published data for SLC10A4 to be a protease-activated transporter for the bile acids LC and TC was not confirmed in the SLC10A4-HEK293 cells. Surprisingly, a reduced ATP accumulation in SLC10A4-HEK293 cells was noted after long incubation times. This effect requires further investigation. In this work a B6.129S5-Slc10a4tm1Lex knockout mouse model was established and successfully backcrossed to the C57BL/6 inbred strain to obtain evidence on the physiological role of SLC10A4. The deletion of the mSlc10a4 gene was confirmed on DNA, RNA and protein level. Now, this mouse model is available for phenotypic analysis.