Human milk oligosaccharides (HMOs) and their effects on intestinal microorganisms

Abstract

Human milk oligosaccharides (HMOs), as the third largest components in human milk, are thought to be important for the development of infants for various reasons. Previous in vitro studies support the idea that HMOs help to build up the human gut microbiota in infants. It has been shown that some of the intestinal microorganisms found in feces of infants grow on single HMOs as sole carbon substrate. However, so far, the growth effect of specific HMO fractions whose pattern is strongly influenced by the mothers Lewis blood group and secretor status on gut bacteria has not been investigated yet.In this study, HMO fractions were isolated from human milk samples with known Lewis blood group specificity (Lewis a, Lewis b and Lewis negative). Human milk was first delipidated and deproteinized followed by an exclusion of lactose by Sephadex G25 Chromatography. The separation of HMO fractions into neutral (n) and acidic (a) fractions was achieved by FPLC-anion exchange chromatography. Resulting fractions and, in addition, single HMO standards as well as glucose, galactose and lactose were used for growth study of microorganisms.The HMO composition of the samples and the Lewis specificity were analyzed by HPAEC-PAD in combination with MALDI-TOF-MS. Fourteen fractions with Lewis a-, Lewis b- or Lewis-negative specificity and five single HMOs (2 -FL, 3-FL, LNT, LNnT and 6 -SL) were tested for their properties to function as growth substrate. According to previous studies and the existence of intestinal microorganisms in infants gut, we selected seven kinds of intestinal microorganisms for the study: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. longum, Bacteroides vulgatus, Cronobacter sakazakii and Akkermansia muciniphila. The growth studies were performed under anoxic condition using specific medium with 1 mM carbon substrates instead of glucose. Growth curves were measured by OD500nm value using spectrophotometer. The carbon substrates in the medium were analyzed by RP-HPLC and the metabolic products (fatty acids) were analyzed by HPLC.From growth studies of L. lactis and L. acidophilus on glucose, galactose and lactose, we found that L. acidophilus grew on glucose, galactose and lactose; L. lactis grew on glucose, low concentration of galactose or lactose. From growth studies of seven microorganisms on 1 mM glucose, galactose, lactose, neutral or acidic HMO fractions and single HMO standards, we found that L. lactis grew well on lactose and on Lewis fractions LeA1n, LeA3n, LeA3a, LeB2n as well as on 3-FL, LNT and 6 -SL; L. acidophilus grew well on lactose, LeA1n, LeA2n, LeA3n, LeB1n, LeB2n, LeA1a, LeB2a, single 2 -FL, 3-FL and 6 -SL; B. infantis grew well on most of the carbon substrates, B. longum could only grow well on some of the substrates. B. vulgatus grew well on lactose, LeA1n, LeA2n, LeB1n, LeB2n, LeB2n, Le0n, Le0a, 2 -FL, LNT and LNnT. C. sakazakii could grow on glucose, lactose and 3-FL, but most carbon substrates seem to have no effect nor inhibitory effect on the growth. A. muciniphila grew well on glucose, lactose, LeA2n, LeA3n, LeB1n, LeB2n, Le0n, LNT and LNnT. Most neutral HMO fractions had better growth effects than acidic HMO fractions on bacterial growth.In order to analyze the carbon substrates before and after cultivation, 2-AA was used for labeling and RP-HPLC was used for quantification. From the analysis of substrates, we found that B. infantis could metabolize almost all the carbon substrates, including mono-, di-saccharides, HMO fractions, and single HMO standards. B. longum could only metabolize some kinds of the HMO fractions, or metabolized some components to some extent.From the analysis of metabolic products using HPLC (analysis for fatty acid detection), we found that both B. infantis and B. longum consumed the carbon substrates, including mono-, di-saccharides, HMO fractions and single HMOs; they mainly produced lactic acid, acetic acid and some formic acid. The amounts of fatty acids produced by B. infantis were mostly larger than those from B. long.In conclusion, HMOs can positively affect the growth of intestinal microorganisms. B. infantis and B. vulgatus grew well on almost all the HMO fractions. B. longum, L. lactis, L. acidophilus grew well on some of HMO fractions. C. sakazakii could grow on only a few carbon substrates whereas single HMOs and Lewis specific fractions seem to have no effect. A. muciniphila grew well on most of the neutral HMO fractions. The results indicated that most neutral HMO fractions had better growth effects than acidic HMO fractions on bacterial growth. In addition, there were no distinct differences between the effects of the various Lewis blood group specific neutral HMO fractions. Aus verschiedenen Gründen wird angenommen, dass humane Milcholigosaccharide (HMOs), die am dritthäufigsten in der Milch vertretenen Komponenten, bei der Entwicklung des Säuglings eine wichtige Rolle spielen. Frühere Studien belegen, dass HMOs am Aufbau der Darmmikrobiota des Säuglings beteiligt sind. In Zellkulturstudien konnte gezeigt werden, dass einige der intestinalen Mikroorganismen, die in Säuglingsfaeces vorkommen, bei Zugabe von bestimmten HMOs als einzigem Kohlenstoff (C)-Substrat wachsen. Bisher wurde jedoch die Auswirkung spezifischer HMO-Fraktionen, deren Muster stark durch die Lewis-Blutgruppe und den Sekretorstatus der Mutter beeinflusst wird, noch nicht auf das Wachstum von Darmbakterien hin untersucht.In der vorliegenden Studie wurden HMO-Fraktionen aus Humanmilchproben mit bekannter Lewis-Blutgruppen-Spezifität (Lewis a, Lewis b und Lewis negativ) isoliert. Nachdem die Milch zunächst entfettet und entproteinisiert worden war, wurde anschließend mittels Sephadex G25 Chromatographie die Lactose entfernt. Mittels FPLC-Anionenaustauschchromatographie wurden die HMO-Fraktionen in neutrale und saure Fraktionen getrennt. Die so entstandenen Fraktionen, einzelne HMO-Standards sowie Glucose, Galactose und Lactose wurden für die Untersuchung des Wachstums der Mikroorganismen benutzt.Die HMO-Zusammensetzung der Proben und die Lewis-Spezifität wurden mittels HPAEC-PAD in Kombination mit MALDI-TOF-MS analysiert. Vierzehn Fraktionen mit Lewis a-, Lewis b- oder Lewis-negativ-Spezifität und fünf einzelne HMOs (2 -FL, 3-FL, LNT, LNnT und 6 -SL) wurden auf ihre Eignung als Wachstumssubstrat untersucht. Entsprechend früheren Studien und den im Säuglingsdarm vorhandenen Mikroorganismen wurden sieben intestinale Mikroorganismen für unsere Studie ausgewählt: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. longum,Bacteroides vulgatus, Cronobacter sakazakii und Akkermansia muciniphila. Die Wachstumsstudien wurden unter Anwendung eines spezifischen Mediums mit 1 mM verschiedener Kohlenstoff-Substrat anstelle von Glucose unter anoxischen Bedingungen durchgeführt. Die Wachstumskurven wurden anhand des OD500nm Wertes mittels Spektrophotometer gemessen, die C-Substrate im Medium anhand von RP-HPLC und die metabolischen Produkte (Fettsäuren) mittels HPLC analysiert.Wachstumsstudien an L. lactis und L. acidophilus mit Glucose, Galactose und Lactose zeigten, dass L. acidophilus erwartungsgemäß mit Glucose, Galactose und Lactose wächst, L. lactis wuchs mit Glucose und mit geringen Konzentrationen von Galactose oder Lactose. Anhand von Wachstumsstudien an sieben Mikroorganismen mit 1 mM Glucose, Galactose, Lactose, neutralen und sauren HMO-Fraktionen und einzelnen HMO-Standards konnte festgestellt werden, dass L. lactis gut auf Lactose und auf den Lewis-Fraktionen LeA1n, LeA3n, LeA3a, LeB2n wie auch auf 3-FL, LNT und 6 -SL wuchs; L. acidophilus wuchs gut auf Lactose, LeA1n, LeA2n, LeA3n, LeB1n, LeB2n, LeA1a, LeB2a, single 2 -FL, 3-FL und 6 -SL; B. infantis zeigte auf den meisten C-Substraten ein gutes Wachstum, B. longum nur mit einigen der Substrate. B. vulgatus wuchs mit Lactose, LeA1n, LeA2n, LeB1n, LeB2n, LeB2n, Le0n, Le0a, 2 -FL, LNT und LNnT gut. C. sakazakii konnte mit Glucose, Lactose und 3-FL wachsen, die meisten C-Substrate jedoch scheinen keine Auswirkungen auf das Wachstum zu haben. A. muciniphila zeigte ein gutes Wachstum auf Glucose, Lactose, LeA2n, LeA3n, LeB1n, LeB2n und Le0n, LNT und LNnT.Um Kenntnisse zur gezielten Verwertung von Kohlenstoffsubstraten durch einzelne Mikroorganismen zu erhalten, wurden Aliquots der jeweiligen Mono-, Di-, oder Oligosaccharide vor und nach der Kultivierung mittels 2-AA markiert und anschließend mittels RP-HPLC quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass B. infantis praktisch alle Kohlenstoffsubstrate metabolisiert hat, einschliesslich Mono- und Di-sacchariden, HMO-Fraktionen sowie einzelnen HMO-Standards. B. longum dagegen metabolisierte nicht alle getesteten HMO-Fraktionen bzw. verwertete manche Substrate nur in geringerem Mengen.Die Analyse der metabolischen Produkten, gemessen an dem Auftreten von Fettsäuren, ergab, dass beide Mikroorganismen die eingesetzten Monosaccharide, Dissaccharide, HMO-Fraktionen und einzelne Standards verwerteten. Dabei wurden hauptsächlich Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure gebildet, wobei die produzierten Mengen bei B. infantis deutlich größer als bei B. longum waren.Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass HMOs das Wachstum intestinaler Mikroorganismen positiv beeinflussen können. B. infantis und B. vulgatus zeigten mit fast allen HMO-Fraktionen ein gutes Wachstum, B. longum, L. lactis, L. acidophilus auf einigen. C. sakazakii konnte nur auf wenigen Kohlenstoff-Substraten wachsen, während einzelne HMOs und Lewis-spezifische Fraktionen keine Auswirkungen zu haben scheinen. A. muciniphila wies auf den meisten der neutralen HMO-Fraktionen ein gutes Wachstum auf, nicht aber auf sauren Oligosacchariden. Die Ergebnisse zeigten, dass die meisten neutralen HMO-Fraktionen das Wachstum der Mikroorganismen eher förderten als saure HMO-Fraktionen. Zwischen den verschiedenen Lewis-Blutgruppen-spezifischen HMO-Fraktionen gab es hinsichtlich der Auswirkungen keine deutlichen Unterschiede.