Kommunikation zwischen Mastzellen und enterischen Neuronen : ein Modell der Nahrungsmittelallergie bei der Ratte

Abstract

Histamin ist ein Mastzellmediator, der bei einer Vielzahl pathophysiologischer Zustände eine Rolle spielt, unter Anderem bei der Nahrungsmittelallergie. Das erste Ziel meines Projekts waren die Charakterisierung des Effektes von Histamin auf submuköse Neurone der Ratte und die Identifizierung der beteiligten Mechanismen. RT-PCR, bestätigt durch immunzytochemische Markierungen, zeigte die Expression der Histaminrezeptoren H1, H2 und H3 auf submukösen Neuronen des Kolons der Ratte. Histamin ruft einen biphasischen Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration in diesen Neuronen hervor hierbei kommt es zunächst zu einer Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern via IP3-Rezeptoren gefolgt von einem Einstrom aus dem Extrazellulärraum. Obwohl Agonisten aller drei Rezeptorsubtypen einen Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration auslösen konnten, zeigten Experimente mit selektiven Antagonisten, dass die Antwort auf Histamin vorwiegend durch H1 (und zu einem geringeren Anteil durch H2) vermittelt wird. Da Histamin und andere Mediatoren durch die Degranulation von Mastzellen freigesetzt werden, war das zweite Ziel der Arbeit die Untersuchung des Zusammenspiels zwischen submukösen Neuronen der Ratte und Mastzellen. In Co-Kultur-Experimenten mit RBL- 2H3-Zellen, einem Mastzelläquivalent, konnte der Mastzelldegranulator Compound 48/80 einen Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration in benachbarten submukösen Neuronen auslösen. Wie schon die Antwort auf Histamin, wurde auch der Effekt von Compound 48/80 durch den H1-Antagonisten Pyrilamin stark gehemmt und durch den H2-Antagonisten Cimetidin reduziert. Eine Beteiligung von proteaseaktivierten Rezeptoren (PAR1 und PAR2) sowie 5-Lipoxygenase an der Reaktion wurde ebenfalls nachgewiesen. Abschließend diente ein Allergiemodell mit Ratten, die gegen Ovalbumin sensibilisiert wurden, der Untersuchung des Effektes von Antigen auf den Kurzschlussstrom (Isc) und die parazelluläre Permeabilität. Ovalbumin induzierte einen Anstieg des Isc, der mit einem Anstieg des parazellulären Fluorescein-Fluxes im Jejunum (jedoch nicht im Kolon) einherging. Pyrilamin hemmte den Anstieg des Isc im Kolon stark, Antagonisten von PAR1 und PAR2 sowie die Blockade von 5-Lipoxygenase konnten den Anstieg ebenfalls reduzieren. 5. Zusammenfassung Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse eine Expression von H1-, H2- und H3-Rezeptoren auf submukösen Neurone der Ratte, wobei H1-Rezeptoren die größte funktionelle Bedeutung zukommt. Das Modell der Co-Kultur aus submukösen Neuronen und RBL- 2H3-Zellen stellt eine geeignete Möglichkeit zur weiteren Untersuchung der Kommunikation beider Zelltypen dar. Histamine is a mast cell mediator involved in a variety of pathophysiologic conditions, e.g. food allergy. The first aim of my project was to characterize the effect of histamine on rat submucosal neurons and the mechanisms involved. Cultured submucosal neurons from rat colon express H1, H2, and H3 receptors as shown by RT-PCR confirmed by immunocytochemical stainings. Histamine evoked a biphasic rise of the cytosolic Ca2+ concentration in these neurons, which consisted of a release of intracellularly stored Ca2+ via IP3 receptors followed by an influx from the extracellular space. Although agonists of all three receptor subtypes evoked an increase in the cytosolic Ca2+ concentration, experiments with antagonists revealed that mainly H1 (and to a lesser degree H2) receptors mediate the response to histamine. As mast cell degranulation leads to release of histamine and other mediators, the investigation of the interaction between rat submucosal neurons and mast cells was the second aim of the study. In coculture experiments with RBL-2H3-cells, a mast cell equivalent, the mast cell degranulator compound 48/80 evoked an increase in the cytosolic Ca2+ concentration of neighbouring neurons. Like the response to native histamine, the neuronal response to compound 48/80 was strongly inhibited by the H1 receptor antagonist pyrilamine and reduced by the H2 receptor antagonist cimetidine. But also protease activated receptors (PAR1 and PAR2) and 5-lipoxygenase took part in the neuronal response to mast cell degranulation. Finally, the use of an allergy model with rats sensitized against ovalbumin allowed the monitoring of short-circuit current (Isc) and paracellular permeability in response to the antigen. Exposure to ovalbumin induced a rise in Isc, which was concomitant with an increase in the paracellular flux in the small intestine (but not in the colon). Pyrilamine strongly inhibited the increase in Isc across the colon, a weaker inhibition was observed after blockade of protease receptors PAR1 and PAR2 or 5-lipoxygenase. Summing up, while rat submucosal neurons express the histamine receptors H1, H2 and H3, H1 receptors seem to play a pivotal role in the interaction between mast cells and the enteric nervous system. The coculture model of submucosal neurons and RBL-2H3 cells appears to be a suitable option for further investigation of their communication.