Molekulare Charakterisierung lignocellulolytischer Enzyme aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus

Abstract

Der Weißfäulepilz Pleurotus sapidus (PSA) sekretiert zahlreiche Enzyme, darunter ligninolytische Redoxenzyme und Hydrolasen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die codierenden DNA-Sequenzen einer Arylalkoholoxidase (AAO), einer Peroxidase vom DyP-Typ (DyP) und einer GDS(L)-Lipase aus dem Sekretom von PSA mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken kloniert und sequenziert.Die Arylalkoholoxidase wurde heterolog in E. coli exprimiert. Da das Enzym hauptsächlich in inclusion bodies abgelagert wurde, wurden mehrere Strategien angewandt, um aktives Enzym direkt in löslicher Form oder durch Rückfaltung aus den inclusion bodies zu gewinnen. Die Fusion mit dem löslichkeitsfördernden Maltose-Bindeprotein führte bei der Expression zu geringen Mengen löslichem, aber dennoch inaktivem Protein. Durch die Koexpression der Arylalkoholoxidase mit Chaperonen bei niedrigen Temperaturen wurden geringe Mengen des Proteins funktionell produziert. Mit den untersuchten Expressionssystemen wurden keine ausreichenden Mengen lösliche, aktive AAO gewonnen. Daher wurde das Enzym schließlich aus inclusion bodies durch Denaturierung gewonnen und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Das solubilisierte Enzym wurde in vitro durch blitzartige Verdünnung (flash dilution) in Rückfaltungspuffer renaturiert. Dabei wurden Aktivitätsausbeuten von ~190 U L-1 erzielt. Die rückgefaltete, gereinigte AAO (AAO*) wurde biochemisch charakterisiert sowie pH- und Temperatur-Optima bestimmt. Daneben wurden die kinetischen Parameter (Km und kcat) sowie die katalytische Effizienz (kcat/Km) für verschiedene Substrate (Benzyl-, p-Anis-, Veratryl- und Zimtalkohol)bestimmt.Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine DyP-Typ Peroxidase aus einer Pleurotus-Art heterolog expimiert. Die rekombinante Produktion erfolgte durch die Firma AB Enzymes in Trichoderma reesei. Für die Reinigung der DyP aus dem Kulturüberstand wurde eine FPLC-Methode etabliert. Das gereinigte Enzym wurde biochemisch charakterisiert und dessen kinetische Parameter für verschiedene Substrate bestimmt. Die rPsaDyP besitzt ein N-terminales Signalpeptid mit einer Länge von 62 Aminosäuren, das reife Enzym besteht somit aus 453 Aminosäuren. Das Enzym hat vergleichbar zu anderen Peroxidasen dieser Familie ein pH-Optimum im sauren Bereich und ist bei diesen Bedingungen über mehrere Stunden stabil. Der pI ist jedoch außergewöhnlich hoch und liegt im neutralen Bereich. Die rPsaDyP wird abhängig vom Substrat durch Wasserstoffperoxid bei vergleichsweise niedrigen Konzentrationen inhibiert. Die Analysemittels Blue Native PAGE und Aktivitätsfärbung mit ABTS zeigte, ebenso wie die Gelfiltrationschromatographie, dass das aktive Enzym als Dimer (115 kDa) vorliegt. Die Untersuchung des Substratspektrums zeigte, dass das rekombinant produzierte Enzym neben einigen klassischen Peroxidase-Substraten auch natürliche Xanthophyllfarbstoffe abbaut. b-Carotin wurde durch die rPsaDyP in An- und Abwesenheit von H2O2 abgebaut, wobei die Enzymaktivität durch den Zusatz von H2O2 gesteigert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die rPsaDyP neben der Peroxidase auch eine Oxidasefunktion besitzt. Die rPsaDyP kann aufgrund ihrer hohen Affinität zu dem Anthrachinonfarbstoff RB5, einem charakteristischen Substrat der DyP-Typ Peroxidasen, auch funktionell diesen Peroxidasen zugeordnet werden. Aus den biochemischen und kinetischen Charakteristika der rekombinanten Arylalkoholoxidase und der rPsaDyP wurden Bedingungen für den Einsatz beider Enzyme in einem System abgeleitet. Die beiden Enzyme wurden kinetisch aufeinander abgestimmt und ein Zwei-Enzym-System etabliert. Dabei wurde das von der Arylalkoholoxidase bei der Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrumaldehyd produzierte H2O2 von der Peroxidase verbraucht. Die untersuchten Modell-Verbindungen wurden im Zwei-Enzym-System effizient umgesetzt. Der Einsatz des Zwei-Enzym-Systems im Labormaßstab zur Oxidation von Ligninkomponenten und zur Bleichung von mit Annatto gefärbter Molke verlief erfolgreich. Die in Trichoderma reesei exprimierte GDS(L)-Lipase (in Kooperation mit AB Enzymes) aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus zeigt nur sehr geringe Homologien zu bereits charakterisierten Lipasen/Esterasen. Die katalytischen Eigenschaften des Enzyms wurden bestimmt und die Substratspezifität des Enzyms in Abhängigkeit von der Acyl-Kettenlänge verschiedener p-Nitrophenylester ermittelt. Aufgrund der höheren Aktivität gegenüber Substraten mit längeren Acyl-Ketten kann das Enzym funktionell den Lipasen zugeordnet werden. Untersuchungen der Hydrolyse von Ferulasäuremethylester und Ferulasäureestern von Polysacchariden zeigten eine geringe Umsetzung dieser Substrate. Daher ist die Art der Beteiligung dieser sekretierten Lipase am Abbau von Lignocellulosen noch unklar.Eine Esterase aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus wurde in Hansenula polymorpha heterolog in unlöslicher Form exprimiert. Durch denaturierende Solubilisierung und Rückfaltung wurde kein aktives Enzym gewonnen. The basidiomycete Pleurotus sapidus (PSA) secretes numerous enzymes, comprising ligninolytic redox enzymes and various types of hydrolases. The coding DNA sequences of an aryl-alcohol oxidase (AAO), a dyp-type peroxidase (DyP) and a GDSL-like lipase from the secretome of PSA were cloned from cDNA libraries and sequenced.Heterologous expression of the aryl-alcohol oxidase in E. coli led to a high level production of recombinant protein mainly in inclusion bodies. Several strategies were used to obtain the protein in a soluble, biologically active form directly or by refolding from inclusion bodies. The expression as fusion protein with maltose-binding protein (MBP), which promotes solubility, resulted in small amounts of soluble, but inactive protein. By coexpression with chaperones at low temperatures small amounts of protein were functionally expressed. Due to the low yield of active protein, the enzyme was extracted from inclusion bodies by denaturation and purified by affinity chromatography. Functional AAO (AAO*) was prepared by refolding of the solubilized enzyme in vitro by flush dilution in refolding buffer. An activity yield up to 190 U L-1 was obtained. The AAO* was characterized and the kinetic constants for different substrates were determined. For the first time, a dyp type peroxidase from a Pleurotus species was expressed heterologously. The enzyme was recombinantly produced in Trichoderma reesei by the company AB Enzymes. A method for purification of the rPsaDyP from culture supernatant of Trichoderma reesei was established. The enzyme was biochemically characterized and the kinetic parameters were determined. The rPsaDyP has an N-terminal signal peptide with a length of 62 amino acids. The mature enzyme is thus composed of 453 amino acids. The enzyme was comparable to other peroxidases of this family, relating to optimum pH in the acidic range and the stability at these conditions. However, the pI is exceptionally high. The enzyme is inhibited by hydrogen peroxide at relatively low concentrations, depending on the substrate used. Analysis by Blue Native PAGE and activity staining with ABTS, as well as gel filtration chromatography, showed the native dimeric state of the enzyme (115 kDa). Analysis of the substrate range revealed that the recombinant enzyme degrades, in addition to some classic peroxidase substrates, also natural xanthophylls. b-carotene was degraded in the presence and absence of H2O2 by the rPsaDyP, although the enzyme activity was increased by the addition of H2O2. This indicates that the rPsaDyP has an oxidase function in addition to a peroxidase activity. Considering the high affinity to the specific substrate the anthraquinone dye RB5 the rPsaDyP belongs also functionally to the dyp-type peroxidase family.Based on the biochemical and kinetic characteristics of the recombinant aryl-alcohol oxidase and the rPsaDyP, conditions for the application of both enzymes in one system were derived. The two enzymes were kinetically adjusted to each other and a two-enzyme system was established. Here, the H2O2 produced by the AAO by oxidation of veratryl alcohol to veratraldehyde was used by the peroxidase, and the investigated model compounds were efficiently transformed in the two-enzyme system. The two-enzyme system was successfully used on laboratory scale for the oxidation of lignocellulosic compounds (2,6-Dimethoxyphenole) and bleaching of annatto coloured whey.The GDSL-like lipase from the secretome of Pleurotus sapidus expressed in Trichoderma reesei (in cooperation with AB Enzymes) shows only weak homologies to previously characterized lipases/esterases. The catalytic properties and the substrate specificity of the enzyme, depending on the acyl chain length of various p-nitrophenyl esters have been determined. Given the higher activity towards longer acyl chains, the enzyme belongs to the lipases. Studies of the hydrolysisof methyl ferulate and feruloylated carbohydrates showed a low conversion of these substrates. Consequently, the role of the secreted lipase in the degradation of lignocellulose is still unclear.An esterase from the secretome of Pleurotus sapidus was expressed in Hansenula polymorpha heterologously in an insoluble form. Enzymatic activity was not obtained by denaturing Solubilisation and refolding.