Interzelluläre Kommunikation durch endotheliale Mikrovesikel-microRNAs : in vitro und in vivo

Abstract

Innerhalb der letzten Jahre wurde gezeigt, dass interzelluläre Kommunikation nicht nur über direkten Zell-Zell-Kontakt, sondern auch über lösliche Trägerstoffe, wie beispielsweise extrazelluläre Vesikel erfolgen kann. Eine ihrer Untergruppen, die 100-1000 nm großen, durch Abschnürung der Plasmamembran entstehenden Mikrovesikel standen im Fokus dieser Arbeit. Da bereits demonstriert wurde, dass Mikrovesikel von Endothelzellen microRNAs (miRs) zu anderen Zellarten transportieren können, war das Ziel dieser Studie zu untersuchen, ob dabei ein spezifisch gerichteter Transfer an bestimmte Zielzellen bzw. Zielgewebe vorliegt.Es ist bekannt, dass Endothelzellen, die laminarer Strömung und damit einhergehend erhöhter Schubspannung ausgesetzt sind, erhöhte Level des Transkriptionsfaktors Krüppel-like factor 2 (KLF2) exprimieren, was zu einer Veränderung der Zusammensetzung des Inhalts der produzierten Mikrovesikel führen kann. Im Verlauf dieser Arbeit sollte daher ebenfalls die Frage beantwortet werden, ob die KLF2-Expression der Mikrovesikel-produzierenden Endothelzellen Auswirkungen auf deren Aufnahme durch Empfängerzellen (in vitro) oder Empfängergewebe (in vivo) hat.In in vitro-Versuchen wurde die vesikuläre miR (cel-miR-39) erfolgreich, aber durchaus in unterschiedlichem Maße in alle untersuchten Empfängerzellarten transferiert. Nach Behandlung mit Mikrovesikeln konnten dabei in Kardiomyozyten, gefolgt von vaskulären glatten Muskelzellen höhere miR-Level gemessen werden als in Endothelzellen. Dabei transferierten die Mikrovesikel von KLF2-Spenderzellen zwar insgesamt mehr der miR, was in diesem Fall allerdings nicht an einer verstärkten Aufnahme, sondern lediglich an bereits in den Mikrovesikel-Spenderzellen erhöhten miR-Leveln lag. Zusätzlich dazu wurden Immunzellen, genauer Monozyten und von diesen zu Makrophagen differenzierte Zellen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die weitestgehend undifferenzierten Monozyten gefolgt von pro-inflammatorischen M1-Makrophagen die höchste Aufnahmerate der Mikrovesikel aufwiesen. Innerhalb aller untersuchten Immunzellen lag im Vergleich zur Kontrolle eine höhere Transfereffektivität nach Inkubation mit KLF2-Mikrovesikeln vor.Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass es quantitative Unterschiede und somit einen gerichteten Transfer der Mikrovesikel von Endothelzellen zu diversen anderen Zellarten gibt, und dass eine vorangegangene KLF2-Transduktion der Spender Endothelzellen die Aufnahme der Mikrovesikel in Immunzellen verstärkt.In vivo konnte eine erfolgreiche Aufnahme der miR-beladenen Mikrovesikel in der Milz von atherosklerotisch aktivierten ApoE-/- Mäusen gezeigt werden, wohingegen in den übrigen untersuchten Organen (Herz, Media & Adventitia der Aorta, aortale Intima, Leber, Niere) nur geringe miR-Spiegel gemessen wurden, die vermutlich nicht als biologisch relevant einzuordnen sind. Des Weiteren waren in durchflusszytometrischen Analysen der Splenozyten keine deutlichen Veränderungen nach Mikrovesikel-Injektion zu erkennen. Lediglich ein leichter Trend zur Reduktion an M1-Makrophagen, sowie zur Reduktion der neutrophilen Granulozyten innerhalb der Milz der ApoE-/- Mäuse nach Injektion von KLF2-Vesikeln konnte beobachtet werden.Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass Mikrovesikel von sowohl untransduzierten, als auch KLF2-transduzierten Endothelzellen die in ihnen verpackte miR hauptsächlich in die Milz von atherosklerotisch aktivierten Mäusen transportieren. Die hier verwendeten und injizierten Vesikel hatten dabei geringe Auswirkungen auf die Zusammensetzung der mononukleären Zellen der Milz. Prinzipiell könnten endotheliale Mikrovesikel eine Möglichkeit darstellen ausgewählte miRs zur Milz von atherosklerotisch aktivierten ApoE-/- Mäusen zu transferieren. In the past few years, extracellular vesicles have been described to take part in cell-to-cell communication. A sub-group of these extracellular vesicles called microvesicles, which are 100-1000 nm in size and are produced through budding off cellular plasma membranes, are in the focus of this study. As microvesicles derived from endothelial cells are known to transfer microRNAs (miRs) to several other cell types, the aim of this study was to elucidate whether such miR-carrying microvesicles are capable of delivering their cargo to specific recipient cells and tissues. It was shown that endothelial cells exposed to laminar flow experience shear stress, which induces expression of the transcription factor Krüppel-like factor 2 (KLF2). Higher KLF2 expression in turn is able to change the composition of endothelial microvesicle-content. In order to answer the question whether KLF2 expression in microvesicle-producing endothelial cells induces differences of vesicle-uptake, endothelial cells were transduced with KLF2 and their microvesicles were analysed for uptake in cells in vitro and in mice.In the in vitro studies, vesicular miR (cel-miR-39) was successfully transferred into all cell types tested, although not to the same extent. After treatment with microvesicles, cardiomyocytes showed higher miR levels than vascular smooth muscle cells, which in turn showed higher uptake than endothelial cells. MiR levels in the recipient cells were increased by overexpression of KLF2 within the donor cells. However this was not due to a better uptake but because of already higher miR-levels within the microvesicle-producing cells. We also investigated immune cells, particularly the uptake of microvesicles in monocytes as well as monocyte-derived M1 and M2 macrophages. We found that mostly undifferentiated monocytes showed the highest vesicle uptake, followed by M1 macrophages. Interestingly, KLF2 overexpression in the donor cells increased uptake of the derived microvesicles within all immune cells. In summary, it can be stated that quantitative differences in uptake exist concerning transfer of miRs via microvesicles from endothelial cells to a variety of recipient cell types in vitro. Additionally, a preceding transduction of microvesicle-producing endothelial cells with KLF2 enhances transfer of miRs to immune cells.In vivo, a significant enrichment of miR-carrying microvesicles was only observed in the spleen of ApoE-/- atherosclerotic mice whereas the miR levels detected within other organs (heart, media & adventitia of the aorta, aortic intima, liver, kidney) were indistinguishable from background and likely biologically irrelevant. The composition of splenocytes after injection of microvesicles did not change considerably. Only a slight reduction in M1 macrophages as well as a reduction in neutrophilic granulocytes within the spleens of ApoE-/- mice could be observed after treatment with miR-containing microvesicles derived from KLF2 overexpressing endothelial cells. These results show that microvesicles coming from untransduced as well as KLF2 transduced endothelial cells transfer miRs mainly into the spleen of ApoE-/- atherosclerotic mice. After injection of microvesicles only slight changes were observed concerning the composition of splenic mononuclear cells. All in all endothelial microvesicles could serve as a vehicle in order to deliver specific miRs into the spleen of ApoE-/- atherosclerotic mice.