Milk sugars beyond lactose : metabolic fate of neutral milk oligosaccharides in infants

Abstract

Free oligosaccharides in human milk (HMO) are complex carbohydrates structurally based on lactose and present at concentrations of 5-20 g/L. They are considered to be resistant to digestion in the breastfed infant s stomach and small intestine, and to serve as energy source selectively for beneficial microbiota in the bowel. Apart from this prebiotic effect, HMO have been found to exert various biological activities in numerous in vitro studies, that indicate not only local functionality in the gut, but also, e.g. immunomodulatory or anti-infective, effects within the body. However, a direct link between structure and function in vivo has not yet been provided. This, in turn, is due to the enormous structural diversity of HMO: More than 150 different structures have been characterized to date. In this work, the metabolic pathways and excretion profiles of HMO were investigated in vivo to extend our knowledge on the sites of HMO utilization or modification and thereby to provide hints on the structure-function relationship of HMO in the infant. Therefore, a platform based on solid phase extraction and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) for a high throughput-profiling of oligosaccharides from human milk, infants urine and feces was established, complemented by isomer separation via liquid chromatography. It was used to follow the time course and possible metabolites of 13C-enriched and non-enriched oligosaccharides in milk and infant urine from ten mother-infant pairs during 36 hours after the application of 13C-galactose to the mothers. Intestinal absorption and subsequent renal excretion of intact structures, in particular (fucosylated) hexaoses, could be deduced for all infants. However, in some infants, excretion was delayed, pointing at a longer gut passage or systemic circulation of those certain structures. Moreover, structure-specific modifications and utilization in the upper parts of the gut, where absorption is thought to take place, were hypothesized. The overall oligosaccharide profiles in the feces of breastfed infants could be categorized into three groups, i.e. i) high diversity with many HMO-like structures, ii) only one or a few oligosaccharides with rather low signal intensity, and iii) no HMO. The patterns showed some association with the infants age. However, further research is needed to investigate the underlying causes, e.g. gut maturity or stool frequency. Novel metabolites were identified in both, infant urine and feces. They could be characterized as acetylated HMO or HMO degradation/modification products, generated by the infants or by their gut microbiota, such as secretor- or Lewis-specific HMO in the feces/urine of infants fed nonsecretor or Lewis-negative milk. Lacto-N-tetraose as a major oligosaccharide in milk was significantly reduced especially in fecal samples. Moreover, the secretor-specific structure lacto-N-fucopentaose I, which is highly abundant in secretor milk, was not detected in the urine of the infants fed Lewis b secretor milk, which indicates a selective utilization of this specific structure. Humanmilch enthält eine Vielzahl an komplexen Kohlenhydraten, die sich biosynthetisch von dem Milchzucker Laktose ableiten. Ihre Konzentrationen betragen mit ca. 5-20 Gramm pro Liter etwa ein Zehntel des Gehalts von Laktose. Bisher wurden zahlreiche biologische Effekte von Humanmilcholigosacchariden (HMO) anhand von Ergebnissen aus in vitro Studien beschrieben. Sie sollen u.a. präbiotisch und antiinfektiös im Darm des gestillten Säuglings wirken. Darüber hinaus könnten sie auch immunmodulierende und andere positive Eigenschaften im Körper haben, sofern die aktiven Substanzen im Dünndarm absorbiert werden. Um den endgültigen Beweis für die Wirksamkeit der einzelnen Substanzen beim Säugling in vivo zu erbringen, wären Interventionsstudien mit Einzelsubstanzen notwendig. Diese sind aufgrund mangelnder Verfügbarkeit synthetischer HMO bislang nicht möglich. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit der Metabolismus und die möglichen Ausscheidungswege von HMO direkt beim gestillten Säugling untersucht, um so Hinweise auf deren Struktur-Funktionsbeziehungen in vivo zu erhalten. Dafür wurde eine analytische Plattform entwickelt, die eine effiziente und zuverlässige Identifizierung von Oligosacchariden aus Muttermilch, Säuglingsurin und -fäzes ermöglicht.In Kapitel 1 der vorliegenden Arbeit werden die aktuellen Kenntnisse zum Metabolismus und der Funktion von HMO sowie die gängigsten Methoden der Glykananalytik anhand von Literatur vorgestellt. Kapitel 2 verdeutlicht die große Relevanz der modernen Glykananalytik für die Erforschung der Struktur-Funktionsbeziehungen von HMO mit Fokus auf spezifische HMO-Strukturen mit Lewis- oder Sekretorepitopen (genetisch determinierte Blutgruppenantigene in Humanmilch).Kapitel 3 beschreibt die praktischen Studien zum Zeitverlauf der HMO-Ausscheidung im Säuglingsurin 36 Stunden nach Einzelgabe von 13C-Galaktose an die Mütter. Mittels Matrix-unterstützter Laser Desorption/Ionizations-Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (MALDI-TOF-MS) wurden bei allen zehn Säuglingen intakte, auch sehr komplexe HMO detektiert. Allerdings war die Exkretion bestimmter Strukturen bei manchen Kindern verzögert, was auf eine individuell längere Darmpassage oder Blutzirkulation dieser hinweist. Des Weiteren gab es Hinweise auf eine unerwartet frühe Metabolisierung bestimmter Strukturen in oberen Darmabschnitten. Die möglichen Metaboliten nach ihrem Abbau oder Modifikation und/oder Aufnahme im Darm wurden bei derselben Probandengruppe mittels MALDI-TOF-MS und Flüssigchromatographie untersucht (Kapitel 4). Diese konnten mittels Tandem-MS als acetylierte HMO oder verschiedene HMO-Abbauprodukte charakterisiert werden, zusätzlich zu HMO-Strukturen, die offenbar erst nach der Aufnahme von den Enzymen des Kindes mit Lewis- und/oder Sekretorepitopen versehen worden waren. Einige Hinweise auf strukturspezifische Utilisation im Darm oder Organismus des Säuglings wurden darüber hinaus erlangt, beispielsweise aufgrund stark verminderter Ausscheidung von Lakto-N-tetraose im Stuhl oder Lacto-N-fukopentaose I im Urin.Die Oligosaccharidmuster von weiteren 24 Säuglingen wurden ebenfalls mittels MALDI-TOF-MS untersucht (Kapitel 5). Dabei wurden drei Untergruppen anhand der HMO-Muster im Stuhl der gestillten Säuglinge im Alter von sechs Wochen beobachtet: i) hohe Diversität an Oligosaccharidstrukturen mit Dominanz von intakten HMO, ii) wenige Oligosaccharide mit eher niedriger Signalintensität und iii) keine HMO oder HMO-Metaboliten. Im Alter von sechs Monaten wurden bei den gestillten Säuglingen keine oder sehr wenige HMO(Metaboliten) detektiert. Des Weiteren konnten bei den formelernährten und bei zwei von drei gemischt ernährten Säuglingen keine Oligosaccharide im Stuhl detektiert werden.In Kapitel 6 werden die neuen Erkenntnisse auf der Basis vorhandener Literatur abschließend diskutiert und es werden Perspektiven für künftige Humanstudien über HMO aufgezeigt.