Protektiver Effekt von NO an der alveolo-epithelialen Barriere bei oxidativem Streß

Abstract

Die Alveolarepithelzelle Typ II spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der alveolo-epithelialen Barriere. Sie limitiert die Passage von Makromolekülen vom Interstitium in den Alveolarraum. Einen wichtigen Pathomechanismus bei der Entstehung des adult respiratory distress syndrome (ARDS) stellt die Schädigung dieser Barrierefunktion in der Alveole durch reaktive Sauerstoffmetaboliten dar. Die vorliegende Arbeit unterstützt die Hypothese, daß Stickstoffmonoxid (NO) protektiv auf die alveolo-epitheliale Barriere bei oxidativem Streß wirkt. Untersucht wurde den Einfluß von H2O2 und NO auf die Barrierefunktion von Alveolarepithelzellen Typ II in Snapwell-Filtern anhand des parazellulären 3H-Mannitolflusses, des alveolaren Kurzschlußstromes (Isc) und der Leitfähigkeit. H2O2 zeigte eine dosisabhängige Schädigung der alveolo-epithelialen Barriere. SNAP und Spermine NONOate, beides NO-Donatoren, zeigten signifikante protektive Effekte bei oxidativem Streß, dadurch daß sie die durch H2O2 verursachte parazelluläre Permeabilitätserhöhung verhinderten. Dabei erwies sich die apikale NO-Applikation als protektiver im Vergleich zur basolateralen Applikation, sowohl bei apikaler als auch bei basolateraler H2O2-Applikation. Der protektive Effekt von NO korrelierte positiv mit höherer NO-Konzentration, wobei eine NO-Konzentration von 250 ppm zwar in Kombination mit H2O2 protektiv, solitär appliziert jedoch schädigend wirkte. Die Phosphodiesterase(PDE)-Inhibitoren IBMX und Zaprinast konnten allein und in Kombination mit NO keinen bzw. keinen zusätzlichen protektiven Effekt auf das oxidativ geschädigte Alveolarepithel bewirken, sondern verminderten den protektiven SNAP-Effekt teils signifikant. Eine Hemmung der zyklischen Guanylatzyklase (cGMP) durch ODQ reduzierte den protektiven Effekt von NO signifikant, während 8-bromo-cGMP keinen protektiven Effekt auf die oxidative Schädigung hatte. Die durch das Polykation Protamin und den Porenbildner E. coli Hämolysin verursachte Schädigung der alveolo-epithelialen Barriere konnte durch NO-Donatoren nicht beeinflußt werden. Im Vergleich zu den NO-Donatoren SNAP und Spermine NONOate zeigten Forskolin und Ilomedin (beides Stimulanzien der Adenylatzyklase) sowie das cAMP-Analogon 8-bromo-cAMP keine protektiven Eigenschaften bezüglich des erhöhten parazellulären Mannitolflusses bei oxidativem Streß. H2O2 verursachte eine signifikante Senkung des alveolaren Kurzschlußstromes und eine signifikante Erhöhung der Leitfähigkeit. Sowohl der Isc-Abfall, als auch der Leitfähigkeitsanstieg konnten in der Kombination mit SNAP, aber kaum mit Spermine NONOate und 8-bromo-cGMP verzögert werden. NO hat demnach bei oxidativem Streß protektive Eigenschaften für die alveolo-epitheliale Barriere. Dabei scheint die antioxidative Eigenschaft von NO im Vordergrund zu stehen. Eine cGMP-Beteiligung ist aufgrund der vorliegenden Experimente denkbar, aber nicht entscheidend. Vielmehr scheint ein komplexes Zusammenspiel von Reaktionen innerhalb und außerhalb der Alveolarepithelzelle für die beobachteten Effekte verantwortlich zu sein. Allerdings ist NO in hohen Konzentrationen toxisch für die alveolo-epitheliale Barriere. Die vorliegenden Befunde eröffnen die therapeutische Perspektive, pharmakologisch das inflammatorische Krankheitsbild des ARDS zu beeinflussen. The alveolar epithelial type II cell has an important role for the alveolar epithelial barrier function. It limits the passage of macromolecules from the interstitial space into the alveolar space. An important factor in the pathogenesis of the adult respiratory distress syndrome (ARDS) is the damage of alveolar barrier function through reactive oxygen species. This doctor thesis supports the hypothesis that nitric oxide (NO) is protective for the alveolar epithelial barrier during oxidative stress. We investigated the effect of H2O2 and NO on the barrier function of alveolar epithelial type II cells grown on snapwell-filters in respect to paracellular 3H-mannitolflux, short circuit current (Isc) and conductibility. H2O2 showed a dose dependent loss of alveolar-epithelial barrier function. SNAP and Spermine NONOate, both NO-donors, showed a significant reduction of H2O2 induced increase of alveolar epithelial paracellular permeability. The apical NO-application was more protective than the basolateral application, when H2O2 was applied apically or basolaterally. The protective effect of NO correlated positively with increasing NO-concentrations, although a NO-concentration of 250 ppm in combination with H2O2 was protective, but was toxic when applied alone. The phosphodisterase (PDE)-inhibitors IBMX und Zaprinast alone and in combination with NO had no and especially no additional protective effect in preventing loss of alveolar epithelial barrier function. They rather reduced the protective effect of NO. The inhibition of the cyclic guanylate cyclase (cGMP) with ODQ reduced the protective effect of NO significantly, whereas 8-bromo-cGMP had not protective effect. The alveolar epithelial leakage response though the polycation protamin and pore forming exotoxin E. coli hemolysin could not be abrogated with NO-donors. In contrast to the NO-donors SNAP und Spermine NONOate Forskolin and Ilomedin (both stimulating agents of the adenylate cyclase) and the 8-bromo-cAMP had no protective properties in respect to the H2O2 induced loss of epithelial barrier function. H2O2 induced also a significant reduction of the short circuit current and a significant increase of the conductibility. The Isc decrease and the conductibility increase could be delayed with SNAP, but hardly with Spermine NONOate and 8-bromo-cGMP. In summary, NO has protective properties for the alveolar epithelial barrier during oxidative stress. Here, the anti-oxidative quality seems to be mainly responsible for the demonstrated effects. cGMP-may play a role, but is not essential. Complex interactions in and outside of the alveolar epithelial cell rather seem to be responsible for the protective effects of NO. Nevertheless, NO is toxic in high concentrations for alveolar epithelial barrier. The results may offer the therapeutic perspective to influence pharmacologically inflammatory diseases as ARDS.