Functional phenotypes of macrophages and their role in influenza A virus induced lung injury and repair

Abstract

Influenza A Virus (IAV)-induced acute lung injury/acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) is a severe complication of IAV infection in humans with often fatal outcome due to lack of effective therapeutic options. It is characterized by severe inflammation in the alveolar compartment of the lung, associated with apoptotic injury of the alveolar epithelium, resulting in loss of barrier function, edema formation and impaired gas exchange capacity with respiratory failure. Alveolar exudate macrophages (ExMa) have been shown to be key players in both driving inflammatory injury to the alveolar epithelium, but also in promoting resolution of inflammation and driving tissue repair processes, and these different functions have been suggested to be associated with the M1 versus M2 polarization phenotype of macrophages, respectively. However, to date, methods to define these phenotypes in pneumonia models in vivo have not been established, nor have the functional properties of M1 and M2ExMa and the signaling pathways or mediators associated with these functions been elucidated, particularly in the context of IAV infection.The presented data provide evidence that ExMa reveal high functional plasticity during IAV-induced ALI/ARDS. Different polarization phenotypes, M1 and M2ExMa, can be defined and separated by a newly established FACS gating strategy, allowing analyses of their gene expression profiles and correlation to their functional properties in IAV-induced lung injury. Quantitative analyses revealed that in the early, acute phase of IAV infection (D7pi), large numbers of M1ExMa infiltrate the alveolar and, to lesser extent, the interstitial space of the lung. Later on, ExMa numbers decline and increasing proportions of M2ExMa are present. By D21pi, low numbers of ExMa are present which are completely polarized towards an M2 phenotype. Of note, bone marrow chimeric mouse models and adoptive ExMa transfer studies into ExMa recruitment-deficient CCR2-/- mice demonstrated that the functional phenotype of M2ExMa is associated with both preservation and replenishment of the rAM pool depleted upon IAV infection, and with regeneration of the alveolar epithelium and improved epithelial barrier function in IAV-induced ALI/ARDS. Transcriptomic profiling of M1 versus M2ExMa revealed highly distinct gene expression profiles, with M1ExMa expressing pro-inflammatory/pro-apoptotic and host defense-associated genes, whereas M2ExMa upregulating anti-inflammatory/anti-apoptotic genes and a high number of epithelial growth factors. The most highly regulated gene in M2 versus M1ExMa was found to be Placenta-expressed transcript 1 (Plet1), a growth factor previously associated with development of epithelial layers, epithelial cell proliferation and formation of epithelial tight junctions. In vitro infection experiments using primary murine alveolar epithelial cells (mAEC) demonstrated that recombinant Plet1 prevented AEC apoptosis and IAV replication, upregulated tight junction-associated proteins and increased tightness of the AEC monolayer. Blockade of Plet1 in M2ExMa by neutralizing antibodies abolished the epithelial-protective properties of M2ExMa in IAV infection in vivo. Orotracheal treatment of IAV infected mice with recombinant Plet1 attenuated inflammation, induced AEC repair, improved alveolar barrier function and increased survival of IAV-induced ALI/ARDS. Together, these data indicate that M1 and M2ExMa are functionally distinct phenotypes evolving during IAV infection, and that M2 programming of ExMa in vivo is protective with respect to alveolar barrier function due to expression of Plet1. Moreover, therapeutic intervention using alveolar deposition of Plet1 might be a useful strategy to improve outcome after ALI/ARDS in humans Das Influenza A Virus (IAV) induzierte akute Lungenversagen/´Acute Respiratory Distress Syndrome´(ARDS) ist eine schwere Komplikation der humanen IAV Infektion mit häufig tödlichem Ausgang aufgrund fehlender effektiver therapeutischer Optionen. Es ist charakterisiert durch eine schwere Entzündung des alveolären Lungenkompartimentes mit apoptotischer Schädigung des Alveolarepithels, was zum Verlust der pulmonalen Schrankenfunktion mit Lungenödem und schwerer Gasaustauschstörung führt. Alveolär rekrutierte (Exudate) Makrophagen (ExMa) sind zentral sowohl an der inflammatorischen Gewebsschädigung des Alveolarepithels als auch an der Entzündungsauflösung und Gewebereparatur beteiligt und diese differenten Prozesse wurden jeweils einer M1 bzw. M2 Polarisation der beteiligten ExMa zugeschrieben. Bisher wurden jedoch weder Methoden etabliert, die es erlauben, diese Polarisationsphänotypen in Pneumonie Modellen in vivo zu unterscheiden, noch wurden bislang insbesondere im Kontext der IAV Infektion das funktionelle Repertoire von M1 vs. M2 polarisierten ExMa und die daran beteiligten Signalwege und Mediatoren aufgeklärt.Die in dieser Arbeit präsentierten Daten geben Hinweise darauf, dass ExMa im Verlauf des IAV-induzierten Lungenversagens/ARDS eine hohe funktionelle Plastizität aufweisen. Mit Hilfe einer neu etablierten ´FACS- Gating´ Strategie ließen sich M1 und M2 ExMa als distinkte Polarisationsphänotypen identifizieren, durchflusszytometrisch separieren und hinsichtlich ihres Genexpressionsprofils sowie ihrer Funktion im IAV-induzierten Lungenversagen charakterisieren. Quantitative Analysen zeigten, dass in der frühen akuten Phase der IAV Infektion (Tag 7 nach Infektion) M1 ExMa in großer Zahl den Alveolarraum und in geringerem Ausmaß das Lungeninterstitium infiltrieren. Später im Infektionsverlauf sinkt die Zahl der ExMa während der Anteil der ExMa mit M2 Polarisierung zunimmt. An Tag 21 nach Infektion sind nur noch wenige ExMa nachweisbar, die alle einen M2 Phänotyp aufweisen. Durch Untersuchungen in Knochenmarks-chimären Mausmodellen und adoptiven Transfer von ExMa in CCR2-/- Mäuse mit einem endogenen ExMa Rekrutierungsdefekt ließ sich zeigen, dass der funktionelle Phänotyp von M2ExMa zur Erhaltung und Regenerierung des durch die IAV Infektion depletierten Zellpools residenter Alveolarmakrophagen (rAM) beiträgt, was zur Regeneration des Alveolarepithels und verbesserter epithelialer Barrierefunktion im IAV induzierten Lungenversagen/ARDS führte. Transkriptomanalysen von M1 vs M2ExMa zeigten distinkte Genexpressionsprofile, wobei M1ExMa pro-inflammatorische/pro-apoptotische und Wirtsabwehr-assoziierte Gene exprimierten, während in M2 ExMa anti-inflammatorische/anti-apoptotische Gene sowie eine hohe Anzahl von Genen, die epitheliale Wachstumsfaktoren kodieren, hochreguliert waren. Das am stärksten in M2 versus M1ExMa hochregulierte Gen war ´Placenta-expressed transcript 1´ (Plet1), ein Wachstumsfaktor, dem bereits eine Rolle bei der Entwicklung von Epithelzellschichten, bei der Epithelzellproliferation und der Formierung von epithelialen ´Tight Junctions´ zugeschrieben worden war. In in vitro Infektionsexperimenten an primären murinen Alveolarepithelzellen (AEC) ließ sich zeigen, dass rekombinantes Plet1 die AEC Apoptose und IAV Replikation verhindert, ´Tight Junction assoziierte Proteine hochreguliert und die Dichtigkeit von AEC Monolayern erhöht. Blockade von Plet1 in M2ExMa durch neutralisierende Antikörper führte zum Verlust der Epithel-protektiven Eigenschaften von M2ExMa im Rahmen der IAV Infektion in vivo. Intratracheale Behandlung von IAV infizierten Mäusen mit rekombinantem Plet1 attenuierte die Inflammation, induzierte AEC Reparatur, verbesserte die alveoläre Barrierefunktion und erhöhte die Überlebensrate von Tieren mit IAV-induziertem ALI/ARDS. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass M1 und M2 ExMa funktionell distinkte Phänotypen im Verlauf der IAV darstellen und dass eine M2 Programmierung von ExMa durch die Expression von Plet1 in vivo protektiv für die alveoläre Barrierefunktion ist. Die alveoläre Deposition von Plet1 als therapeutische Intervention könnte deshalb eine nützliche Strategie sein, um das Behandlungsergebnis bei Patienten mit ALI/ARDS zu verbessern.