Die Succinatdehydrogenase als Mediator in der pulmonalen hypoxischen Vasokonstriktion : eine Arbeit mit Succinatdehydrogenase-D gendefizienten Mäusen (SDHD +/-) am Modell der isoliert perfundierten Lunge und in histologischer Betrachtung

Abstract

Das Prinzip der der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion (HPV) ist seit langem bekannt, ihr Mechanismus ist aber trotz intensiver Forschung bisher ungeklärt. Die HPV ist physiologisch für das pulmonale Ventilations-/Perfusionsverhältnis verantwortlich, chronische generalisierte Hypoxie führt zur Ausprägung einer pulmonalen Hypertonie mit einem vaskulären Umbauprozess. Unter Umständen ist die HPV für die Entwicklung einer pulmonalen Hypertonie (PH) mitverantwortlich, der Gefäßumbauprozess könnte jedoch auch von der HPV unabhängig stattfinden.Die Succinatdehydrogenase (SDH), ein Enzym der mitochondrialen Atmungskette und des Zitratzyklus besteht aus vier Untereinheiten. Mitochondrien stehen derzeit als Sensor-Organellen der HPV und des Gefäßumbaus nach chronischer Hypoxie in der Diskussion.In dieser Arbeit wurden Mäuse verwendet, die heterozygot für die Untereinheit D der SDH gendefizient sind. Daraus resultierte eine 50%ige Einschränkung der Funktionsfähigkeit der SDH, eine Hochregulation des verbliebenen Gens konnte im Vorfeld nicht nachgewiesen werden. Es handelt sich um die bisher einzige Möglichkeit die Funktion der SHD in der HPV zu evaluieren, die nicht von einer pharmakologischen Intervention abhängt.Das Model der isoliert perfundierten Lunge bietet die Möglichkeit sich mit der aus dem Gesamtorganismus entfernten und somit von dessen Einflüssen unabhängigen und dennoch in ihrer physiologischen Reaktion weitgehend erhaltenen Lunge zu befassen. Am Modell der isoliert perfundierten Lunge wurden die Organe akuter Hypoxie oder dem Thromboxananalogon U-46619 ausgesetzt und der pulmonalarterielle Druckunterschied gemessen. Diese Versuche wurden an Tieren durchgeführt, die zuvor drei Wochen entweder unter normoxischen oder hypoxischen (10% Sauerstoff, normobar) Bedingungen gehalten worden waren. Die Versuche wurden in An- und Abwesenheit des Stickstoffmonoxid(NO)-Synthese-Inhibitors L-NG-Nitroarginin (L-NNA) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Reduktion der HPV nach chronischer Hypoxie in Anwesenheit von L-NNA im Vergleich zu den normoxisch gehaltenen Tieren beider Genotypen und im Vergleich zu einem U-46619 induziertem pulmonalen Druckanstieg, welcher nach chronischer Hypoxie stärker ausgeprägt war. Die weist auf einen NO-unabhängigen Mechanismus der Herunterregulation der HPV unter chronischer Hypoxie hin. Jedoch ist hier kein Einfluss des Genotyps (Wildtyp vs. SDHD +/-) auf die HPV-Stärke detektierbar.Weitere Versuche bezogen sich auf die Stärke der Vasokonstriktion unter prologierter hypoxischer Beatmung von Lungen beider Genotypen über drei Stunden. Die SDHD +/- Tiere zeigten am Ende der dreistündigen Hypoxiephase ein höheres Vasokonstriktionsniveau als die Wildtypen. Dies spricht für die Bedeutung der SDH für eine Antagonisierung der Stärke der prolongierten HPV und somit für Unterschiede in den Regulationsmechanismen, die der prolongierten hypoxischen Vasokonstriktion im Vergleich zur akuten hypoxischen Vasokonstriktion zugrunde liegen. In den histologischen Auswertungen wurden die intrapulmonalen Gefäße und ihr Muskularisierungsgrad beurteilt. Die Lungen der zuvor drei Wochen unter hypoxischen (10% Sauerstoff, normobar) oder normoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere wurden histologisch aufgearbeitet und die Gefäße in drei Größen unterteilt (20-70µm, >70-150µm und >150µm). Anschließend wurden die Gefäße der verschiedenen Durchmesser auf ihren Muskularisierungsgrad hin mikroskopisch analysiert. Hier zeigten sich keine Unterschiede zwischen den untersuchten Genotypen, der Muskularisierungsgrad war jedoch in den kleinen Gefäßen nach hypoxischen Haltungsbedingungen höher. Paddenberg et al. (2012) konnten zeigen, dass intraazinär gelegene Gefäße von 20-40µm Durchmesser in Tieren mit einem SDHD +/- Defekt unter Hypoxie einen Verlust der hypoxischen Vasokonstriktion aufweisen. In Zusammenhang mit diesen Untersuchungen lassen die eigenen Untersuchungen darauf schließen, dass es diesbezügliche Unterschiede zu größeren Gefäßen in Bezug auf die untersuchten SDHD +/- Tiere gibt, da in den in dieser Arbeit zur Anwendung gekommenen isolierten Lungenversuchen nur Widerstandsgefäße der pulmonalen Strombahn erfasst wurden, die größere Gefäßdurchmesser als 40µm auswiesen. Auch sind kongenitale Effekte des globalen heterozygoten SDHD +/- Gendefekts in Betracht zu ziehen. Der SDHD könnte also eine wesentliche Bedeutung für die Regulation der HPV zukommen, die jedoch in weiterführenden Untersuchungen, z. B. an konditionellen homozygoten SDHD -/- Tieren determiniert werden müsste.Unter prolongierter dreistündiger Hypoxie zeigten die SDHD +/- Tiere eine zu den Wildtypen signifikant erhöhte Vasokonstriktion zum Ende einer dreistündigen hypoxischen Ventilation. Die unterstreicht eine mögliche differentielle Bedeutung des SDH-Defekts nicht nur für die akute, sondern auch für die prolongierte HPV, hier als möglicher Antagonist. Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) has been known long since, intensive research on the ventilation-/perfusion matching mechanism of the lung started in 1946 with the studies of Euler and Liljestrand. Despite intensive research, the underlying mechanism(s) of oxygen sensing cell(s), pathway(s) of signal transduction and effector cell(s) have not yet been fully understood. HPV is responsible for pulmonary ventilation-/ perfusion matching, chronic hypoxia leads to pulmonary hypertension (PH) and to vascular remodeling. HPV could be playing an important role in the development of PH, however PH could also be caused by different mechanisms yet to be discovered.Succinate dehydrogenase (SDH), a mitochondrial enzyme in the respiratory chain and in the Krebs cycle, consists of four subunits. Mitochondria are being discussed as possible mediators of HPV and vascular remodeling as a result of chronic hypoxia. In this investigation mice with a heterozygous genetic deficiency for subunit D of SDH were used. Resulting from the heterozygote deficiency in SDHD was a SDHD activity lowered by 50%, an upregulation of the remaining gene could be excluded. Until today studying heterozygote genetically deficient mice as described above (SDHD +/-) is the only way to research SDHD deficiency without depending on pharmacological intervention.The isolated perfused lung as an experimental setting gives the opportunity to focus on the lung separated from the organism and therefore independent of its influences but still acting largely as one unit in its original physiological way. In this model tissues were exposed to acute hypoxia or the thromboxan analogon U-46619 while changes in pulmonary artery pressure were registered. The experiments were performed with animals that had previously been kept under chronic hypoxic (10% oxygen, normobaric) or normoxic conditions for three weeks. The experiments were performed in the absence and presence of the nitric-oxide(NO)-synthetase inhibitor L-NG-nitroarginine (L-NNA). Results showed a significant reduction of HPV under the influence of L-NNA in animals previously kept under chronic hypoxic condition in comparison to the pulmonary vasoconstriction induced by U-46619 and in comparison to HPV of animals previously kept under normoxic conditions. This suggests a mechanism of downregulation of HPV under chronic hypoxia which is independent from NO; a difference in genotype (Wildtyp vs. SDHD+/-) could not be detected in this setting. Further experiments concentrated on the pulmonary vasoconstriction of the lungs exposed to a prolonged hypoxic ventilation phase of three hours. Here SDHD +/- animals were acting on a higher level of hypoxic pulmonary vasoconstriction towards the end of the three hour trial. This highlights the importance of a functioning SDHD antagonising the strength of hypoxic pulmonary vasoconstriction in prolonged hypoxia, and draws attention to differences in the regulating mechanisms underlying prolonged hypoxic vasoconstriction versus acute hypoxic vasoconstriction. In histological examination the grade of muscularisation of intrapulmonary vessels was the focus of interest. Pulmonary vessels of animals previously kept under chronic hypoxic (10% oxygen, normobaric) or normoxic conditions were histologically evaluated and classified into three sizes (20-70µm, >70-150µm and >150µm). Subsequently the vessels of different calibers were analyzed considering their grade of muscularisation.Significant differences between genotypes could not be shown, still the grade of full vascularisation was higher for small vessels after animals had previously been kept under hypoxic conditions.Paddenberg et al. (2012) demonstrated that intraacinary vessels of 20-40µm in diameter originating from SDHD +/- animals presented with a loss of hypoxic vasoconstriction under hypoxia. Concerning Paddenbergs et al. results the findings on hand suggest differences between vessels of 20-40µm in diameter in comparison to larger vessels as the pulmonary vessels studied with the model of isolated lung were pulmonary resistive vessels of 40µm or more in diameter. Congenital effects of global heterozygote deficiency have to be considered additionally. SDHD could be holding a key position in the regulation of HPV, further investigation preferably on conditionally homozygotic SDHD -/- animals are necessary to clarify this position.Under three hours of prolonged hypoxia SDHD +/- animals presented with a significantly higher level of vasoconstriction towards the end of the experiments. This highlights a possible additional influence of SDH deficiency not only in acute but also in prolonged hypoxia, here as a possible antagonist.