Knochen-Tissue-Engineering im Critical Sized Femurdefektmodell der Ratte nach Bestrahlung

Abstract

Ziel der ersten Phase dieser Arbeit war die Untersuchung der Auswirkung unterschiedlicher Bestrahlungsprotokolle auf Rattenknochen zur Etablierung eines reproduzierbaren Modells eines vorgeschädigten Femurs. Das Modell sollte anschließend in der zweiten Phase verwendet werden, um die Knochenheilung durch einen heterotop gezüchteten artifiziellen Knochengewebsersatz in einem Femurdefekt kritischer Größe (critical sized femoral defect, CSFD) nach Bestrahlung zu untersuchen.In der ersten Phase wurden 4 Bestrahlungsprotokolle verglichen: 1x Bestrahlung mit 20 Gy und Explantation nach 4 Wochen (Gruppe A), 1x Bestrahlung mit 20 Gy und Explantation nach 8 Wochen (Gruppe B), 3x fraktionierte Bestrahlung mit je 10 Gy und Explantation nach 4 Wochen (Gruppe C) sowie 3x fraktionierte Bestrahlung mit je 10 Gy und Explantation nach 8 Wochen. Als Vergleich diente das jeweilige kontralaterale, unbestrahlte Bein. Die Auswertung erfolgte neben der klinisch-makroskopischen Evaluation mittels Histologie, Mikro-CT und quantitativer PCR. Zusätzlich wurden zwei im Knochenmark vertretene Zelllinien osteogen differenzierte mesenchymale Stammzellen und endotheliale Vorläuferzellen bestrahlt und die Genexpression mittels qPCR ausgewertet.In der Histologie zeigte sich besonders in den 4-Wochen-Gruppen (A und C) infolge der Bestrahlung eine deutliche Vakuolisierung des Knochenmarks, die als Ödem und fettige Degeneration interpretiert werden kann. Weiters kam es zu einer Abnahme der Zellzahl in der Kortikalis sowie der Anzahl an Hif1& #945; positiven Zellen im Knochenmark. Die durch die Bestrahlung bedingte Abnahme der Gefäßanzahl sowie der Anzahl der CD31 positiven Zellen im Knochenmark waren nicht signifikant. Die quantitative PCR zeigte eine verminderte Expression mehrerer Zielgene in Gruppe A (Osteocalcin, RUNX2, TGFb1, TNFa, VEGF-A, Hif1a) sowie einen Trend zur vermehrten Expression von Hif1a, ALP, Osteocalcin und Osteopontin in Gruppe B, was auf einen verminderten Metabolismus mit anschließender Reparatur hinweist. Das Mikro-CT ergab eine signifikante Abnahme der kleinkalibrigen Gefäße infolge der Bestrahlung in Gruppe A und D. Für die zweite Phase dieser Arbeit wurde das Protokoll der Gruppe A gewählt.In der zweiten Phase wurde zunächst in Spendertiere eine Titankammer subkutan in die Leiste eingesetzt. Diese enthielt in den Gruppen E10d, E12Wo, bE10d und bE12Wo eine Mischung aus silikatsubstituiertem Hydroxyapatit, rekombinantem humanem BMP-2, osteogen differenzierten MSCs und Fibrin. In den Gruppen F und bF enthielt die Kammer nur silikatsubstituiertes HA und Fibrin. Nach 6 Wochen wurden die Kammern entnommen und in einen CSFD in syngenen Empfängertieren eingesetzt. Als Kontrolle dienten Defekte, die durch eine leere Kammer überbrückt wurden (Gruppe G, bG). In den Gruppen bE10d, bE12Wo, bF und bG wurden die Empfängertiere 4 Wochen vor der Defektsetzung bestrahlt, die Gruppen E10d, E12Wo, F und G dienten als unbestrahlte Kontrollen. Die Explantation der Konstrukte erfolgte 10 Tage (E10d, bE10d) oder 12 Wochen nach Defektsetzung (E12Wo, bE12Wo, F, bF, G, bG). Die Auswertung bestand neben der klinisch-makroskopischen Evaluation aus Röntgenaufnahmen, Histologie, Mikro-CT und qPCR.In den Gruppen E10d, bE10d, E12Wo und bE12Wo war eine deutliche Knochenbildung sichtbar. In den bestrahlten Defekten der Gruppe bE12Wo war die Knochenfläche signifikant niedriger als in Gruppe E12Wo. In zwei Konstrukten der Gruppe E12Wo kam es zu einer knöchernen Überbrückung zwischen Konstrukt und Femur. In den Gruppen F und bF konnte weder eine Knochenbildung im Konstrukt noch eine knöcherne Überbrückung festgestellt werden. In den unbestrahlten Leerdefekten der Gruppe G zeigte sich ein Einwachsen der Femurstümpfe in den Defekt, jedoch keine Überbrückung desselben. In Gruppe bG kam es nur in zwei Defekten zu einem geringen Auswachsen der Femurstümpfe. Das Zellüberleben der implantierten MSCs war signifikant niedriger in Konstrukten der Gruppe bE10d, verglichen mit der Gruppe E10d, ebenso die Gefäßanzahl. In der qPCR zeigte sich im Vergleich zu gesundem Knochen eine signifikant verminderte Expression von Osteocalcin und ALP sowie eine gesteigerte Expression von Osteopontin und Hif1a.Sowohl die kritische Größe des Femurdefekts als auch die effiziente Hemmung der Knochenbildung durch die Bestrahlung wurden anhand der Leerdefekte nachgewiesen. Die Kombination aus HA, rhBMP-2 und MSCs konnte eine gute Knochenbildung erzielen. Die Verwendung von silikatsubstituiertem HA alleine hingegen führte zu keiner Förderung der Heilung. Die geringe Expression der Osteoblastenmarker ALP und Osteocalcin deuten auf eine geringe Osteoblastenaktivität hin, die in zukünftigen Projekten verbessert werden sollte. Die verminderte initiale Vaskularisation durch die Bestrahlung führte zu einem verminderten Überleben der implantierten MSCs sowie zu einer langfristig gesteigerten Expression des Hypoxiemarkers Hif1a.