Etablierung eines standardisierten Protokolls für die Synthese von peracetylierten N-Acyl-Mannosamin-Derivaten als artifizielle Sialinsäurevorläufermoleküle und ihr Einfluss auf das angioproliferative Potenzial von humanen umbilicalen Endothelzellen

Abstract

Die Sialinsäurebiosynthese weist eine hohe Substratpermissivität auf, sodass die Sialylierung leicht durch Einbringung von chemisch modifizierten Vorläufermolekülen verändert werden kann.N-Acetyl-Mannosamin-Derivate sind gut charakterisiert und die am häufigsten eingesetzten Substanzen, um die Zellsialylierung zu modulieren. Das bisher eingesetzte Protokoll für die Synthese von N-Acyl-Mannosamin-Derivaten zeigt eine geringe Reaktionsausbeute und erfordert eine HPLC-Reinigung der Produkte. ManNAc und seine artifiziellen Analoga werden zudem nur in geringem Ausmaß von Zellen aufgenommen und umgesetzt.In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues, dreischrittiges Protokoll für die Synthese von O-Ac4-ManNAc, O-Ac4-ManNProp und O-Ac4-ManNBut etabliert, das bei einer Ausbeute von 100 % und reinen Produkten, die keiner Reinigung bedürfen, zusätzlich die Synthese von peracetylierten Komponenten gestattet, die zelluläre Membranen leichter permeieren können.Dabei konnte festgestellt werden, dass Mannosamin im sauren und alkalischen Milieu eine Tendenz hat, zum thermodynamisch stabileren Glucosamin zu epimerisieren. Im nächsten Schritt wurden humane umbilicale Endothelzellen, A549-Lungenepithel- und Caco-2-Darmepithelzellen mit den Substanzen behandelt. Die Biokompatibilitätsprüfung zeigte dabei keine nennenswerte Cytotoxizität. Durch Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie konnte gezeigt werden, dass O-Ac4-ManNProp und O-Ac4-ManNBut zu den korrespondierenden N-Acyl-Neuraminsäuren umgesetzt und in zelluläre Glykoproteine inkorporiert wurden.HUVECs wurden nach Substanzinkubation mikroskopischen Analysen unterzogen, um Veränderungen in ihrem angioproliferativen Potenzial zu detektieren. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung mit dem physiologischen Vorläufer ManNAc zu einer deutlich reduzierten Angiogenese führt, während die Behandlung mit und O-Ac4-ManNBut eine gesteigerte Kapillarbildung zur Konsequenz hat. Ausgehend von den gewonnenen Daten kann also postuliert werden, dass zentrale Prozesse der Angiogenese durch die physikochemischen Eigenschaften der Aminogruppe von Sialinsäuren vermittelt werden, die folglich durch Behandlung mit N-Acyl-Mannosamin moduliert werden können. The sialic acid biosynthetical pathway exhibits a wide substrate permissivity. Thus, sialylation can easily be modified through application of chemically altered precursor molecules. In this regard, N-acetyl-mannosamine-derivatives are characterized quite well and preferred as substrates to alter cell sialylation.The preexisting protocol for the synthesis of N-acyl-mannosamine exhibits a low yield and the products need to be purified via LC. ManNAc and its artificial derivatives are only able to penetrate cellular membranes to a small extent. Hence, only a small fraction of the applied substances is actually transformed into their corresponding artificial sialic acids.Whithin this doctoral thesis it was possible to establish a new and standardized three-step protocol for the synthesis of O-Ac4-ManNAc, O-Ac4-ManNProp and O-Ac4-ManNBut. The yield was approximately 100% and the final substances showed no byproducts, making additional purification steps unnecessary. Additionaly it allows the synthesis of peracetylated products with increased cellular uptake.During the process it could be determined that mannosamine exhibits a tendency to transform into its thermodynamically more stable epimer glucosamine under acidic and alkaline conditions. The substances were subsequently applied to different cell lines - human umbilical endothelial cells, A549 pulmonal epithelial cells and Caco-2 intestinal epithelial cells. As shown before, they proved to be fully biocompatible, showing no increase in cytotoxicity. Furthermore, as affirmed by means of liquid chromatography and mass spectrometry, O-Ac4-ManNProp and O-Ac4-ManNBut were successfully metabolized to the corresponding artificial sialic acids, which were subsequently incorporated into cellular glycoproteins. HUVECs were analyzed microscopically to determine any change in their angioproliferative capacity after incubation with the respective ManNAc-analogue. HUVEC-spheroids showed a decrease in capillary sprouting when cells were treated with the physiological precursor ManNAc. Incubation with O-Ac4-ManNBut, however, lead to increased angiogenesis. The obtained data suggest that certain critical steps in angiogenesis are mediated by the physicochemical properties of the amino-residue in sialic acids. These can in consequence be modulated through application of N-acyl-mannosamine.