Expression und Regulation des Adrenomedullin-Signalwegs in sympathischen paravertebralen Ganglien der Maus

Abstract

Ein Vorkommen von Peptiden der Calcitonin-Peptidfamilie ist in fast allen Organen des Körpers in verschiedenen Spezies beschrieben. Vor allem CGRP und AM sowie AM2/IMD sind bekannt für Ihre neuromodulatorischen Eigenschaften. Ein Einfluss auf zentrale sympathische Zentren wurde für AM und AM2/IMD sowie für CGRP bereits beschrieben. In dieser Arbeit wurden die Expression und Regulation des AM-Signalwegs in sympathischen paravertebralen Ganglien der Maus untersucht.Es wurden männliche C57Bl6/N Mäuse unter Standardbedingungen sowie nach eintägiger Exposition mit 10% normobarer Hypoxie untersucht. Das Vorkommen und die Quantifizierung von CGRP, AM, AM2/IMD sowie des gesamten CLR-Rezeptorkomplexes wurden mittels Immunhistochemie und quantitativer real-time RT-PCR (qPCR) bestimmt. Mechanismen der Expressionsteigerung wurden in Ex Vivo-Stimulationsversuchen in explantierten Ganglien nach elektrischer Feldstimulation und pharmakologischer Stimulation untersucht. Der Einfluss von AM auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde an isolierten postganglionären sympathischen Neuronen des SCG gemessen.Diese Arbeit zeigte anhand qPCR und Immunhistochemie eine Expression von AM und AM2/IMD in sympathischen paravertebralen Ganglien der Maus. CGRP fand sich in sensorischen Nervenfasern und in präganglionären Axonen aus dem Rückenmark. Im initialen Organscreening zeigte sich nach Hypoxie in der qPCR ein signifikanter Anstieg von AM im rechten Ventrikel des Herzens und in der Lunge sowie von AM2/IMD im SCG. Eine weiter gehende Analyse des SCG zeigte nach eintägiger Hypoxieexposition einen signifikanten Anstieg der mRNA-Konzentration von AM, AM2/IMD, RAMP1 und RAMP2. Hierfür ist keine generelle Hypoxie verantwortlich, da Marker direkter Gewebehypoxie (TrkB und Endothelin1) zwar in der Lunge, nicht aber im SCG anstiegen. Sowohl eine pharmakologische Stimulation mit CGRP, Muskarin oder Nikotin als auch eine elektrische Feldstimulation bewirkten keine Expressionsteigerung von AM in isolierten Ganglien. In Life-Cell-Imaging-Experimenten führte AM unter den von uns gewählten Versuchsbedingungen nicht zu Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration isolierter SCG Neurone und hatte keinen Einfluss auf den Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration nach Nikotingabe.Die Ergebnisse zeigen erstmals die Expression des vollständigen AM(2)-Signalwegs in sympathischen paravertebralen Ganglien sowie dessen Regulation unter Hypoxieexposition, deren Mechanismen noch weiterer Abklärung bedürfen. The occurrence of peptides of the calcitonin-peptide family is described in more or less every organ in different species. Especially for CGRP, AM and AM2/IMD, neuromodulatory properties are known. An influence on central sympathetic centres is described for AM and AM2/IMD as well as for CGRP. The present work addressed expression and regulation of the AM-signalling pathway in sympathetic paravertebral ganglia of the mouse.Male C57Bl6/N mice were investigated under standard conditions and after exposure to 10% normobaric hypoxia. Occurrence and quantification of CGRP, AM, AM2/IMD as well as of the whole CLR receptor complex were analysed by immunohistochemistry and quantitative real-time RT-PCR (qPCR). Mechanisms of increase in mRNA-expression were analysed by ex-vivo stimulation of explanted ganglia either by electric field stimulation or by pharmacological stimulation. The influence of AM upon intracellular calcium concentration was measured in isolated postganglionic sympathetic neurons of the SCG. This work demonstrated expression of AM and AM2/IMD in sympathetic paravertebral ganglia of the mouse by immunohistochemistry and qPCR. CGRP was present in sensory nerve fibres and in preganglionic fibres origin from the spinal cord. An initial qPCR organ screening after hypoxic exposure showed a significant increase in AM-mRNA expression in the right cardiac ventricle and in the lung. For AM2/IMD, enhanced mRNA-expression was measured in the SCG. Further analysis of the SCG after exposure to hypoxia for one day revealed significantly increased mRNA-levels of AM, AM2/IMD, RAMP1 und RAMP2. For this effect, general hypoxia is not responsible, because markers of hypoxic tissue (TrkB and endothelin1) were elevated only in the lung but not in the SCG. Neither pharmacological stimulation with CGRP, muscarine and nicotine nor electric field stimulation increased AM-mRNA-expression in isolated ganglia. In life-cell-imaging, AM had no effect upon intracellular calcium concentration in isolated SCG neurons. Further, it had no effect on the increase in intracellular calcium concentration evoked by nicotinic stimulation. This work is the first to describe the expression of the entire AM(2)-signalling pathway in sympathetic paravertebral ganglia and its regulation under conditions of hypoxic exposure. The underlying mechanisms of hypoxic regulation need further investigation.