Untersuchungen zur Aufnahme und Elimination von Gallensäure-Oligonukleotid-Konjugaten und ihren Antisense-Eigenschaften

Abstract

Die Galleausscheidung von eines 15mer mixed backbone Oligodeoxynukleotids (n-ODN) und seines 3 ,5 -Bis-Gallensäure-Konjugates (2G-ODN) wurde an anästhetisierten Ratten untersucht. Hierbei war die in situ-Ausscheidung des 2G-ODN mit bis zu 25 % der applizierten Menge vier bis fünf Mal höher als die des n-ODN. Mrp2-defiziente TR--Ratten schieden insgesamt nur 40-50 % dieser Menge aus. Im Gegensatz zu Wistarratten zeigte sich bei der biliären Sekretion der Oligonukleotide durch TR--Ratten kein exkretorischer Peak, sondern eine Schulterbildung. Um eine Beteiligung des mrp2 an der biliären Exkretion der Oligonukleotide zu untersuchen, wurden mehrere Substrate canaliculärer Transporter kurz vor Injektion der Oligonukleotide appliziert und die in situ-Galleausscheidung der Oligonukleotide bestimmt. Unter diesen Substraten befanden sich die beiden mrp2-Substrate BSP und S 3025. Bei S 3025 handelt es sich um ein neuartiges Chlorogensäurederivat, das die Glucose-6-Phosphat-Translokase inhibiert. S 3025 hemmt die Ausscheidung des oatp1/mrp2-Substrates BSP, die des Ntcp/Bsep-Substrates Taurocholat jedoch nicht. Sowohl BSP als auch S 3025 hemmten die Galleausscheidung der Oligonukleotide in konzentrationsabhängiger Weise. BSP führte bei Wistarratten zu einer konzentrationsabhängig verzögerten Ausscheidung der Oligonukleotide, veränderte die sezernierte Gesamtmenge jedoch nicht. Dagegen nahm die hepatobiliäre Sekretion der Oligonukleotide bei TR--Ratten nach Präinjektion von BSP weiter ab. Das Chlorogensäurederivat S 3025 verzögerte den Verlauf und verringerte die Gesamtmenge der Oligonukleotidausscheidung bei Wistarratten in konzentrationsabhängiger Weise; die Hemmwirkung war beim 2G-ODN stärker als beim n-ODN. Auf die Oligonukleotid-Ausscheidung der mrp2-defizienten TR--Ratten hatte S 3025 keinen Einfluss. Bei Wistarratten werden n-ODN und 2G-ODN vermutlich hauptsächlich über den mrp2 in die Galle sezerniert. Fehlt dieser Transporter, erfolgt die Ausscheidung über den ebenfalls zur ABC-Carrierfamilie gehörenden Transporter Bsep. Hierbei werden die Gallensäure-konjugierten Oligonukleotide noch besser ausgeschieden als n-ODN über den mrp2. Im Falle einer Applikation von 15 µmol BSP bei Wistarratten bzw. 5 µmol BSP bei TR--Ratten nahm die Oligonukleotidmenge in der Leber stark ab und in der Niere zu. Nach Applikation von 5 µmol S 3025 erhöhten sich bei Wistarratten die Oligonukleotidmengen in Leber und Serum; bei TR--Ratten wurden keine Veränderungen festgestellt. Die Gabe von 15 µmol S 3025 verminderte die Oligonukleotidmengen in allen Organen, woraus gefolgert wurde, dass die Oligonukleotidausscheidung über den mrp2 über den gesamten Versuchszeitraum stark inhibiert war. Da mrp2 in vielen Organen exprimiert wird, besonders in Leber, Niere und Lunge, war die Verweilzeit der Oligonukleotide im Blut verlängert, aus dem sie schließlich über den im renalen Tubulus exprimierten mrp1 in den Urin sezerniert wurden. Gallensäure-konjugierte Phosphorothioate sind prinzipiell für Antisense-Anwendungen geeignet. Wurde die cRNA des basolateralen Transporters Ntcp der Ratte in Gegenwart eines Antisense-Oligonukleotids, an das zwei Cholsäuremoleküle in 3 - und 5 -Position gekoppelt wurden, inkubiert und anschließend in Xenopus laevis-Oozyten injiziert, ging die Ntcp-Expression unabhängig von einer Gallensäurekonjugation oder Backbone-Modifikation der Antisense-Oligonukleotide drastisch zurück. Endonuclease-stabile mixed backbone Phosphorothioat-Oligonukleotide bleiben während einer Leberpassage in vivo intakt. Sowohl Gallensäure-konjugierte als auch unkonjugierte Oligonukleotide werden rasch in die Galle ausgeschieden, wobei die Gallensäurekonjugation den Anteil des in die Galle sezernierten Oligonukleotids um das Vier- bis Fünffache steigert. Die Ausscheidung erfolgte hauptsächlich über den canaliculären Transporter mrp2. Daneben spielt jedoch vermutlich noch ein weiterer, über den Bsep-Transporter laufender Ausscheidungsweg eine Rolle. Gallensäure-konjugierte Phosphorothioat-Oligonukleotide sind geeignete Kandidaten für Antisense-Therapien bei Lebererkrankungen: Die Backbone-Modifikation erhöht die Nukleasestabilität, die Gallensäurekonjugation erhöht die Leberpassage, und eine Antisense-Wirkung bleibt von beiden Strukturveränderungen unberührt. Biliary excretion of a 15 mer mixed backbone oligodeoxynucleotide (n-ODN) and its 3 ,5 -bis bile acid derivative (2G-ODN) was investigated by examining anesthetized rats. The in situ bile excretion of 2G-ODN by wistar rats revealed that up to 25 % of the applied dose, resp. four to five times more than that of n-ODN, were excreted via the biliary pathway. Mrp2 deficient TR- rats showed an overall excretion of 40-50 % of the amount secreted into bile by wistar rats. In contrast to the excretory curves obtained with wistar rats, biliary secretion of oligonucleotides by TR- rats did not show an excretory peak, but a shoulder which remained constant over a long period of time. In order to determine the participation of mrp2 in the hepatobiliary excretion of oligonucleotides, several substrates of different canalicular transporters were applied shortly before oligonucleotide injection and the in situ bile secretion of the oligonucleotides was investigated subsequently. Among these were mrp2 substrates BSP and S 3025. S 3025 represents a novel chlorogenic acid derivative which inhibits glucose-6-phosphate translocase. S 3025 inhibits the biliary excretion of the oatp1 / mrp2 substrate BSP but not that of the Ntcp / Bsep substrate taurocholate. Both BSP and S 3025 inhibited hepatobiliary secretion of the oligonucleotides in a concentration-dependent manner. In wistar rats, BSP preinjection delayed oligonucleotide excretion in a concentration-dependent manner, wereas no influence on total excretory amount was observed. On the other hand, the oligonucleotide secretion of TR- rats diminished in the presence of BSP. S 3025 caused a delayed excretion of both oligonucleotides and a reduction in the total amount excreted. The extent of these effects depended on the S 3025 concentration and also on the oligonucleotide; 2G-ODN was more strongly affected by the inhibitory effect of S 3025 than n-ODN. On the contrary, S 3025 had no influence on oligonucleotide excretion of mrp2-deficient TR- rats. Probably mrp2 is the main excretory pathway for n-ODN and 2G-ODN in Wistar rats. If this transporter is lacking biliary excretion occurs via the ABC carrier Bsep. The excretion of bile acid-conjugated oligonucleotides via Bsep is even more efficient than excretion of unconjugated oligonucleotides via mrp2.Preinjection of 15 µmol BSP / wistar rat resp. 5 µmol BSP / TR- rat led to increased amounts of oligonucleotides in livers, whereas the amounts in the kidney decreased. Due to the injection of 5 µmol S 3025, total oligonucleotide amounts in the liver and serum of wistar rats increased; under the same conditions, TR- rats showed no effect. After application of 15 µmol S 3025, total oligonucleotide amounts decreased in any examined organ of wistar rats which could be a consequence of overall inhibition of oligonucleotide excretion via the mrp2 pathway during the whole period of measurement. As mrp2 is expressed in many organs, especially in the liver, kidney and lung, oligonucleotides were retained in blood for a longer period of time and finally excreted into urine via mrp1, which is expressed in the renal tubules. Bile acid-conjugated phosphorothioates are suitable tools for antisense applications. If the cRNA of the rat basolateral transporter Ntcp was incubated together with an antisense oligonucleotide bearing cholic acid molecules on both the 3 and 5 end and subsequently injected into Xenopus laevis oocytes, Ntcp expression diminished drastically. This inhibitory effect did not depend on backbone modification or bile acid conjugation of the antisense oligonucleotides. Endonuclease-resistant bile acid-mixed backbone phosphorothioate oligonucleotide conjugates remain intact during liver passage. Conjugated as well as unconjugated oligonucleotides are rapidly excreted into bile, whereby bile acid conjugation leads to a four- to five fold increase of the biliary excreted part of the applied oligonucleotides. Hepatobiliary excretion mainly occurs via the canalicular transporter mrp2. Furthermore, an additional excretory pathway involving Bsep transporter contributes to biliary excretion of oligonucleotides. Bile acid conjugated oligonucleotides are suitable candidates for antisense therapies of liver diseases: backbone modification confers a higher nuclease stability, bile acid conjugation bestowes a better passage through liver, and antisense effects remain unchanged by either of these structural modifications.