Untersuchung zur Rolle von Nrf2-Agonisten in der Regulation der Eisenhomöostase

Abstract

Nach der Eisenmangelanämie stellt die Anämie der chronischen Entzündung, kurz ACI, die Anämieform mit der zweit höchsten Prävalenz dar. Anämie gehört bei Patienten mit chronischen Entzündungen, wie chronisch entzündlichen Darmerkrankungen oder Adipositas, zu einer der häufigsten extraintestinalen Manifestationen und führt zu einer beeinträchtigten Lebensqualität und erhöhten Hospitalisierungsrate dieser Patienten. Die Pathogenese der ACI wird durch erhöhte Serumspiegel von proinflammatorischen Zytokinen ausgelöst, zu denen vor allem das Interleukin-6 (IL-6), aber auch Oncostatin M (OSM) zählen. Diese induzieren in Leberzellen und zu einem geringeren Teil auch in Makrophagen, die Expression von Hepcidin, das heute als systemischer Eisenregulator bekannt ist. Hepcidin vermittelt seine Wirkung durch die Bindung an den bislang einzig bekannten Eisenregulator Ferroportin. Dadurch wird dieser internalisiert und degradiert, wodurch das Eisen in den Zellen verbleibt und dem Körper nicht mehr zur Verfügung steht. Dies führt somit zu einem funktionellen Eisenmangel und letztlich zu einer Anämie. Die Beeinflussung der Hepcidin-Ferroportin-Achse spielt deshalb bei der Therapie der ACI bei Patienten mit chronischen Entzündungen eine wesentliche Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Substanzen zu finden, die in der Lage sind, durch eine verminderte Zytokin-induzierte Hepcidin-Expression und/oder eine erhöhte Ferroportin-Expression die Hepcidin-Ferroportin-Achse zu beeinflussen. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf den Transkriptionsfaktor Nrf2 gelegt. Die Aktivierung dieses Faktors stellt durch die nachfolgende Genaktivierung von Phase II-Proteinen den wohl wichtigsten Signalweg für die Abwehr von oxidativem Stress sowie Giftstoffen dar und trägt damit zum Zellschutz bei. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Nrf2-Aktivatoren Dimethylfumarat (DMF), Sulforaphan und 15-Deoxy-Δ12,14 Prostaglandin J2 (15d-PGJ2) in der Lage sind in HepG2-Leberkarzinomzellen der IL-6- bzw. OSM-induzierten Hepcidin-Expression auf Promotor- und mRNA-Ebene entgegenzuwirken. Dieser Effekt konnte für IL-6 auch auf Proteinebene gezeigt werden. Auch in Typ1 Makrophagen führte 15d-PGJ2 auf mRNA-Ebene zu einer Hemmung der Hepcidin-Expression. Die Untersuchung dieses beobachteten Effekts zeigte, dass die Nrf2-Aktivatoren nicht zu einer veränderten Phosphorylierung des IL-6- und OSM-induzierten Transkriptionsfaktors STAT3 führten, der durch die Bindung an das STAT3 responsive Element im Hepcidin-Promotor die Hepcidin-Expression induziert. Somit wurde eine Hemmung des IL-6-STAT3-Signalweges durch DMF, SFN und 15d-PGJ2 ausgeschlossen. Um zu überprüfen, inwiefern Nrf2 an der Vermittlung der Hepcidin-Hemmung durch die verwendeten Substanzen beteiligt ist, wurde Nrf2 überexprimiert sowie ein Nrf2-Knockdown durchgeführt. Es konnte dabei jedoch kein Einfluss von Nrf2 auf die Hemmung der Zytokin-induzierten Hepcidin-Expression durch die Nrf2-Aktivatoren festgestellt werden. Auch die Mutation der im Hepcidin-Promotor identifizierten möglichen Nrf2-Bindestelle, der sogenannten ARE-Sequenz, führte nicht zu einer veränderten Hepcidin-Hemmung durch DMF, SFN und 15d-PGJ2, weshalb der beobachtete Hemmeffekt unabhängig von Nrf2 auftritt. Neben dem Einfluss auf die Hepcidin-Expression konnte auch eine Beeinflussung der Ferroportin-Expression durch die verwendeten Substanzen aufgezeigt werden. Alle drei Substanzen induzierten die Ferroportin-Expression auf mRNA-Ebene. Dieser Effekt war nicht nur abhängig von Nrf2, sondern auch von dessen Zielgen Hämoxygenase-1 (HO-1). Auch die mRNA-Expression des Eisenspeicherproteins Ferritin wurde durch DMF, SFN und 15d-PGJ2 induziert und konnte durch den Knockdown von Nrf2 und HO-1 inhibiert werden. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Substanzen DMF, SFN und 15d-PGJ2 die Hepcidin-Ferroportin-Achse beeinflussen können, indem die Hepcidin-Expression Nrf2-unabhängig runter reguliert und die Ferroportin-Expression Nrf2/HO-1-abhängig induziert wird. Vor allem das für Psoriasis und Multiple Sklerose zugelassene Arzneimittel DMF könnte damit ein vielversprechendes Medikament zur Behandlung einer ACI darstellen. Darüber hinaus zeigen neue Studien an Mäusen, dass DMF effektiv bei der Behandlung von Colitis bei Mäusen ist, weshalb der Einsatz von DMF bei Patienten mit CED und Anämie durch weitere Studien untersucht werden sollte. Anemia is one of the most common extraintestinal manifestations of chronic inflammatory conditions including inflammatory bowel disease and obesity. The detrimental effects of anemia on patient quality of life and hospitalization rates are well documented. After iron deficiency, chronic inflammation is the second most prevalent etiology of anemia in these patients (anemia of chronic inflammation, ACI). The pathogenesis of ACI is triggered by raised serum levels of proinflammatory cytokines, particularly interleukin-6 (IL-6) and oncostatin M (OSM), which induce the expression of hepcidin in the liver cells and, to a lesser extent, in the macrophages. Hepcidin is known to play a role in systemic iron regulation by binding to the only currently known iron transporter, ferroportin. As a result, ferroportin is internalized and degraded, trapping iron in the cells and reducing its availability in the body, and thus causing functional iron deficiency and, ultimately, anemia. Manipulation of the hepcidin-ferroportin axis is therefore a promising therapeutic target for the treatment of ACI in patients with chronic inflammatory disease.The aim of this research was to identify substances capable of influencing the hepcidin-ferroportin axis, either by diminishing cytokine-induced hepcidin expression, or by upregulating the expression of ferroportin. The transcription factor Nrf2 was hereby a particular focus of attention: The genetic transcription of phase-II proteins via Nrf2 activation probably represents the most important signaling pathway for the body s immune response to oxidative stress and toxins. Nrf2 thus plays an essential role in cell protection.In this research project, three Nrf2 activators, dimethyl fumarate (DMF), sulforaphane (SFN) and 15-Deoxy-Δ12,14 Prostaglandin J2 (15d-PGJ2) were shown to counteract IL-6 or OSM-induced hepcidin expression at promotor and mRNA level in HepG2 liver carcinoma cells. This effect was also shown for IL-6 on protein level. In addition, 15d-PGJ2 had a suppressive effect on hepcidin expression in type 1 macrophages at mRNA level. Further experiments showed the phosphorylation of the IL-6 and OSM-induced transcription factor STAT3, which stimulates hepcidin expression by binding to the STAT3 responsive element of the hepcidin promoter, to be unaffected by DMF, SFN and 15d-PGJ2, thus ruling out a possible inhibition of the IL-6-STAT3 signaling pathway by the Nrf2 promoters.Nrf2 hyperexpression and Nrf2 knockdown were used to investigate possible effects of Nrf2 on cytokine-induced hepcidin downregulation triggered by the tested substances. However, hepcidin expression was found to be independent of Nrf2 in these models. Similarly, hepcidin downregulation by DMF, SFN und 15d-PGJ2 was shown to be unaffected by a mutation brought about in the Nrf2 binding site in the hepcidin promoter, the so-called ARE sequence.Besides affecting hepcidin levels, the tested substances were demonstrated to influence the expression of the iron transporter ferroportin, with all three substances causing the induction of ferroportin on mRNA level. This effect was dependent not only on Nrf2, but also on its target gene, hemoxygenase-1 (HO-1). Furthermore, mRNA expression of the iron storage protein, ferritin, was induced by DMF, SFN and 15d.PGJ2 and, conversely, inhibited in Nrf2 and HO-1 knockdown models.Taken together, these data show that DMF, SFN and 15d-PGJ2 are capable of influencing the hepcidin-ferroportin axis via Nrf2-independent downregulation of hepcidin and concurrent Nrf2/HO-1-dependent induction of ferroportin. In particular, DMF, which has already gained approval for the treatment of psoriasis and multiple sclerosis, seems a promising therapeutic option in patients with ACI. Moreover, DMF has been shown to be an effective treatment for colitis in mouse models, suggesting the need for further studies to investigate its therapeutic potential in patients with inflammatory bowel disease and anemia.