Klonierung zweier Rattensertolizelllinien mit stabiler Expression eines humanen Androgenrezeptors unterschiedlicher CAG-Repeat-Länge als in vitro Modell zur Untersuchung testosteronabhängiger, mit der Spermatogenese assoziierter Gene

Abstract

Androgene spielen für den Ablauf der Spermatogenese eine Schlüsselrolle. Ihre Wirkung wird über den Androgenrezeptor (AR) vermittelt, dessen genetische Information sich auf dem X-Chromosom befindet und aus 8 Exonen besteht. Exon 1 codiert für eine repetitive Sequenz, das sogenannte CAG-Repeat. Die Länge des CAG-Repeat variiert physiologisch von 9 bis 36 Repeats. Es gibt bezüglich der CAG-Repeat-Länge und dessen Einfluß auf die androgenabhängige Transaktivierung des AR verschiedene Ergebnisse. Einige Autoren sehen einen Zusammenhang mit der CAG-Repeat-Länge, andere nicht.In dieser Arbeit ist anhand eines neu entwickelten Sertoli-Zellmodels dieser Zusammenhang exemplarisch an der mRNA- und Proteinexpression von Clusterin (Sulphated Glycoprotein-2), einem ubiquitär exprimierten Glykoprotein, untersucht worden. Clusterin ist ein ursprünglich in der Prostata gefundenes Androgen-reprimiertes Gen, das im Hoden hauptsächlich in Sertoli-Zellen exprimiert wird. Clusterin wird mit einer Reihe von physiologischen Funktionen, wie Zell-Zell-Interaktionen und Apoptose in Zusammenhang gebracht. Daher erschien Clusterin als ein guter Marker für die geplanten Untersuchungen Zunächst wurden zwei komplette hAR mit den CAG-Repeat Längen 18 und 36 in einen Expressionsvektor mit einem anhängenden GFP kloniert. Jeder dieser beiden Vektoren wurde in die präpubertären Ratten-Sertoli Zellen 93RS2 transfiziert, die keinen eigenen AR exprimieren. Die zwei neuen Sertoli Zelllinien 93RShAR18 und 93RShAR36 wurden mittels RT-PCR, quantitativer RT-PCR und Western Blot charakterisiert, um sicherzustellen das der transfizierte hAR exprimiert wird und sowohl auf mRNA-Ebene, als auch auf Proteinebene nachweisbar ist. Nach der Stimulation mit Testosteron konnte nicht ausgeschlossen werden, dass sich die CAG-Repeat-Länge bei der Replikation in den Zelllinien geändert hatte. Die Bestimmung der CAG-Repeat-Länge erfolgte durch eine SDS-PAGE-PCR. Es zeigte sich der Verlust eines CAG bei den 93RShAR18 und der Verlust von 3 CAG bei den 93RShAR36, daher wurden die Zellen für die Stimulationsversuche in 93RShAR17 und 93RShAR33 umbenannt.Ohne die Stimulation mit Testosteron konnten in den beiden Zelllinien 93RShAR17 und 93RShAR33 nahezu identische Expressionslevel von hAR und Clusterin gezeigt werden. Nach Stimulation mit Testosteron ergaben sich lediglich bei der Testosteronkonzentration von 10-6 M in dem 93RShAR33-Zellensystem und bei den Testosteronkonzentrationen 10-6 M und 10-7 M in dem 93RShAR17-Zellsystem leichte Veränderungen in der Genexpression von Clusterin. Im Vergleich der beiden Zellsysteme 93RShAR17 und 93RShAR33 ergaben sich keine nennenswerten Unterschiede in der Expression von Clusterin und dem hAR auf mRNA-Ebene. Auf Proteinebene konnten mittels ELISA nach Stimulation mit den Testosteronkonzentrationen 10-6 M und 10-7 M über 48 Stunden statistisch signifikante Unterschiede in der Clusterinkonzentration (ng/ml) im Vergleich der beiden Zellsysteme mit den untransfizierten 93RS2-Zellen, als auch im Vergleich der Zellsysteme untereinander gemessen werden. Diese Unterschiede waren gering, so dass ihnen keine wirklich unterschiedliche Trankskriptionaktivität des AR unterstellt und damit eine biologische Bedeutung beigemessen werden konnte. Für diese beiden Zellsysteme konnte somit kein relevanter Unterschied in der Transaktivierungsfunktion des AR mit unterschiedlicher CAG-Repeat-Länge innerhalb der physiologischen Varianz, bezogen auf die Expression von Clusterin, gefunden werden. In einer weitergehenden Arbeit mit diesen Zellsystemen konnte an mehreren Kandidatengenen für die Spermatogenese gezeigt werden, dass nur die Transfektion des AR, ohne eine Testosteronstimulation, schon zu einer veränderten Expression führte. Androgens play key roles in spermatogenesis. Their effects are mediated by the androgen receptor (AR), being located on the X chromosome and consisting of 8 exons. Exon 1 encodes a polyglutamine (CAG) repeat with a polymorphic length between 9 and 36. A connection between the CAG repeat length and the testosterone dependent transactivation of the AR is still in discussion. We want to examine this possible connection exemplary for AR dependent genes at the mRNA- and protein expression of clusterin (Sulphated Glycoprotein-2, Clu). Clu is one of the major proteins secreted by Sertoli cells in the testis. It was first lokalised in prostate and is known as an Androgen depressed gen, with a variety of physiological roles. So it might be predestined it as a good marker for this present studie. First two full length human AR (hAR), CAG repeat length 18 and CAG repeat length 36 were created and cloned into an expression vector with a terminal GFP. Each of them was transfected in the prepubertal rat Sertoli cell line 93RS2. Before transfection it was assured that this cell line does not express an own AR by PCR. The new cell lines 93RShAR18 (18 CAG) and 93RShAR36 (36 CAG) were characterized by RT-PCR, quantitative RT-PCR and Western blot. So the expression of the transfected hAR could be varified in the two new Sertoli cell lines 93RShAR18 and 93RShAR36 as well on mRNA- as on protein level. After stimulation with testosterone, it was necessary to review the sequence of the AR, because in the Sertoli cells CAG repeats could get lost by replication failure. We lost one CAG in the 93RShAR18 and three CAG in the 93RShAR36 cells. So for the stimulation experiments we renamed the cells in 93RShAR17 and 93RShAR33.Without testosterone stimulation the mRNA expression of hAR and Clu in the transfected cell lines was nearly equal. The mRNA expression of hAR after stimulation with testosterone in five different concentrations seems only minor regulated. Only minor differences in Clu mRNA expression by quantitative RT-PCR in comparison of the transfected cell lines 93RShAR17 and 93RShAR33 among themselves and in comparison of the transfected cell lines 93RShAR17 and 93RShAR33 with the untransfected 93RS2 cells was found. The Clu mRNA expression in the 93RShAR33 only showed a minor alteration at 10-6 M in the 93RShAR17 at 10-6 M and 10-7 M. In comparison between the two transfected Sertoli cell lines among themselves, and among the untransfected 93RS2 cell line a significant difference in the protein expression of Clusterin could be detected. But this difference is relatively small, so it could not attached this small effect to a biological relevance. For this two Sertoli cell models a supposed measurable difference in transactivation of hAR with different CAG repeat length in a physiological range by the protein-expression of Clu did not exist. In a further study of candidate genes for spermatogenesis, it was shown by micro-array, that only the transfection of the hAR, without stimulation of testosterone, already had effects on the expression of this candidate genes of spermatogenesis.