Differenzielle Zytokinantwort bei Ziegen nach experimenteller Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

Abstract

Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete, chronische Enteritis der Wiederkäuer, die durch Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) hervorgerufen wird. Besonderes Merkmal der Erkrankung ist die regelmäßig sehr lange Inkubationszeit, während derer weder Methoden der direkten noch der indirekten Infektionsdiagnostik zuverlässig anwendbar sind. Für eine effiziente Kontrolle der Tierseuche mangelt es daher an adäquater Diagnostik für die frühe Infektionsphase. Geeignete Impfstoffe stehen nicht zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit war es, die begonnene Entwicklung eines detailliert definierten Infektionsmodells mit Ziegen fortzusetzen. Weiterhin sollte über ein vertieftes Verständnis der (Immun)Pathogenese das diagnostische Potenzial von Methoden zum Nachweis der zellulären Immunantwort überprüft werden.Achtundzwanzig Thüringer Waldziegen wurden im Alter von durchschnittlich 16 Tagen mit MAP (Stamm JII-1961) inokuliert. Über 51 Wochen wurden vierwöchentlich mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) gewonnen und mit Johnin (JPPD), Geflügeltuberkulin, den rekombinanten MAP-Proteinen MAP 1365, MAP 0268c, MAP 3651c oder BLAg restimuliert. Die so induzierte Produktion von Interferon-g (IFN-g) und Interleukin(IL)-10 wurde mittels enzyme linked immunosorbent assay auf Proteinebene und die von IL 10, IL 12p40, IL 18, Transforming Growth Factor b und Tumornekrosefaktor a (TNF-a) mittels Polymerase-Ketten-Reaktion auf Genexpressionsebene quantifiziert. Die Expression des Differenzierungsmarkers (CD) CD25 auf CD4+ und CD8+ Gedächtniszellen wurde durchflusszytometrisch quantifiziert. Zur Einschätzung des Infektionsstatus wurden Daten zur Ausscheidung von MAP mit dem Kot, dem serologischen Status sowie der Bakterienlast der Tiere zu vier definierten Sektionszeitpunkten drei, sechs, neun und zwölf Monate post inoculationem (p.i.) herangezogen. Sechzehn nicht-infizierte Tiere dienten als Kontrolle.Der 100-prozentige Inokulationserfolg bestätigte, dass das angewandte Inokulations¬schema geeignet ist, eine Infektion mit MAP im Tiermodell sicherzustellen. Trotz der Unterschiede zur natürlichen Infektion (vor allem im zeitlichen Verlauf) bietet das Modell eine gute Grundlage für die Bearbeitung weiterführender Fragestellungen. Die angewandten Methoden zeigten sich geeignet, die zelluläre Immunantwort auf MAP darzustellen und Kontroll- und Versuchstiere zu unterscheiden. Nach umfänglicher Validierung der Methoden konnten methodische Fehler ausgeschlossen werden. Die infizierten und nicht-infizierten Tiere ließen sich anhand ihrer zellulären Immunantwort auf MAP früher differenzieren als anhand der humoralen Immunantwort bzw. der MAP-Ausscheidung. Am deutlichsten war dies in der Freisetzung von IFN-g durch JPPD-stimulierte PBMC. Die Differenzierung von Kontroll- und Versuchstieren anhand dieses Parameters gelang ab der dritten Woche p.i. und damit acht Wochen früher als anhand von MAP-spezifischen Antikörpern. Der direkte Nachweis von MAP in Kotproben gelang ebenfalls ab der dritten Woche p.i., der IFN-g-Test zeigte dabei jedoch ab der elften Woche p.i. mehr richtig-positive Ergebnisse. In der Genexpression von IL-12p40 und TNF-a sowie in der Expression von CD25 auf CD4+ und CD8+ Gedächtniszellen waren ebenfalls Gruppen-Unterschiede anhand JPPD-stimulierter PBMC erkennbar.Durch Verwendung MAP-spezifischer Antigene bzw. IL-10-blockierender Antikörper ließ sich die Spezifität bzw. die Sensitivität des IFN-g-Tests steigern. MAP 3651c induzierte von den getesteten MAP spezifischen rekombinanten Proteinen die stärkste IFN-g-Antwort, welche jedoch deutlich hinter der auf JPPD zurückblieb. Weiterhin zeigten sich Unterschiede innerhalb der Gruppe der inokulierten Versuchstiere, die darauf hindeuten, dass immunpathologische Prozesse in der frühen Phase der Infektion den Verlauf der Erkrankung bei Ziegen bestimmen. So zeigten die Tiere, die die Infektion mit MAP vergleichsweise gut kontrollieren konnten und wenig MAP ausschieden, zu einem frühen Zeitpunkt immunologische Charakteristika, die ursächlich für die effektive Kontrolle der Infektion sein könnten. Bei JPPD-stimulierten PBMC dieser Tiere war die Produktion von IFN-g, IL 10 und IL 12p40 sowie die Expression von CD25 auf CD4+ und CD8+ Gedächtniszellen zu einem frühen Zeitpunkt p.i. höher als bei den restlichen infizierten Tieren. Das verwendete Infektionsmodell sowie die angewandten Methoden zur Quantifizierung der zellulären Immunantwort auf MAP wiesen zwar Optimierungspotential auf, zeigten sich jedoch grundsätzlich geeignet um verschiedene Fragestellungen der Paratuberkuloseforschung zu adressieren. Damit liefert diese Arbeit sowohl eine adäquate Grundlage als auch interessante Ansatzpunkte für weiterführende Untersuchungen.