Untersuchung zur morphologischen Integrität der organotypischen Retinakultur von adulten C57Bl6 Mäusen

Abstract

Um mutationsbedingte degenerative Netzhauterkrankungen wie Retinitis pigmentosa therapieren zu können, stellt die Methode der Gentherapie eine vielversprechende Option dar. Hierbei sollen zelleigene DNA-Reparaturmechanismen genutzt werden, um die mutierte Gensequenz durch ein exogenes korrektes DNA-Konstrukt auszutauschen. In dieser Arbeit wurde die adulte organotypische Retinakultur von C57Bl6- Wildtypmäusen charakterisiert, um beurteilen zu können, ob diese sich als intermediäres Modell zwischen Zellkultur und in-vivo-Experimenten eignet, um die Methodik der Gentherapie erforschen zu können. Hierfür wurden Retinaexplantate präpariert und anschließend im Brutschrank bis zu 10 Tage kultiviert. Nach Entnahme erfolgte die Fixation und Einbettung im Gefriermedium und die Herstellung von Kryostatschnitten. Die Charakterisierung erfolgte anhand von Immunfluoreszenzfärbungen der Proteine der retinalen Neurone (PKCa+CtBP2), Gliazellen (GFAP+ GS), DNA-Schadens- und Reparaturproteine (gH2AX, 53BP1, Ku80, CtIP) sowie durch Apoptosenachweis mittels TUNEL-Assay und Immunfärbung von AIF. Im Laufe der Arbeit konnten zwei morphologisch unterschiedliche Phänotypen differenziert werden, die als glatte und raue Explantate benannt wurden. Die Ursache für das Auftreten konnte nicht abschließend geklärt werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Morphologie der glatten Explantate über die gesamte Dauer der Kultur im Allgemeinen erhalten blieb, wohingegen die rauen Explantate Veränderungen aufwiesen. Bei den rauen Explantaten blieb eine Gliose aus, ferner fiel der apoptotische Nachweis mittels TUNEL-Assay stark positiv aus und war widersprüchlich zu dem nicht entsprechend schnell fortschreitenden Zelltod. Bei den glatten Explantaten kam es nach 4 Tagen zu leichten gliotischen Veränderungen, was mit den Phasen der Degeneration in der Retina bei degenerativen Netzhauterkrankungen übereinstimmte und als kulturbedingte Erscheinung angesehen werden kann. Der Zellkernverlust der Photorezeptoren war langsam fortschreitend, ebenfalls erkennbar am TUNEL-Nachweis. Bei beiden Phänotypen kam es zu einer Zunahme der DNA-Doppelstrangbrüche. Nachgewiesene DNA-Reparaturproteine zeigten, dass bedingt durch die invertierte Chromatinstruktur der Stäbchenphotorezeptoren bei den nachtaktiven Mäusen keine Reparatur der DNA- Doppelstrangbrüche im Heterochromatin erfolgte. Eine Umverteilung von Ku80 aus der OPL in die ONL hat bei beiden Phänotypen stattgefunden und bekräftigt die Bedeutung von Ku80 im Reparaturprozess von DNA-Doppelstrangbrüchen. Die Arbeit hat gezeigt, dass bei den glatten Explantaten bis zum 6. Tag in Kultur nur wenige Veränderungen auftraten. Daher eignen sich die glatten Explantate im Gegensatz zu den rauen, um die Methoden der Gentherapie zu untersuchen. To be able to treat mutation-induced degenerative retinal diseases, such as retinitis pigmentosa, gene therapy counts as a promising option. Cellular DNA repair mechanisms are supposed to be used to exchange the mutated gene sequence trough an exogenous correct DNA construct. In this work, the adult organotypic retina culture of C57Bl6 wildtype mice was characterized to determine whether it is suitable as an intermediate model between cell culture and in vivo experiments to study the methods of genome editing. For this purpose, retina explants were dissected and then cultured for up to ten days. After removal, explants were fixed and embedded into freezing medium and cryostat sections were produced. Characterization was carried out by immunofluorescence staining of the proteins of retinal neurons (PKCa+CtBP2), glia cells (GFAP+ GS), DNA damage and repair proteins (gH2AX, 53BP1, Ku80, CtIP) and by apoptosis detection via TUNEL assay and immunostaining of AIF. During this work two morphological different phenotypes, which were titled as smooth and rough explants, were differentiated. The cause of the occurrence could not be conclusively clarified. The results showed that the morphology of the smooth explants was generally maintained throughout the duration of the culture, while the rough explants showed variations. In the case of the rough explants, a gliosis failed, and the apoptotic detection by TUNEL assay was strongly positive, which was contradictory to the not corresponding strong progressive cell death. In the case of the smooth explants, light gliotic changes occurred after four days, which corresponded to the phases of degeneration in the retina and could be regarded as a culture-conditioned phenomenon. The loss of the photoreceptor nuclei was slowly progressing also shown by TUNEL assay. In both phenotypes, DNA double- strand fractures increased. Detected DNA repair proteins showed that due to the inverted chromatin structure of rods of the nocturnal mice, no repair of double strand breaks in the heterochromatin occurs. A redistribution of Ku80 from the OPL to the ONL in both phenotypes has taken place and confirms the importance of Ku80 to the DNA repair process of double strand breaks. This work has shown that in the case of the smooth explants, only a few changes occurred until the sixth day in culture. Therefore, the smooth explants, unlike the rough ones, would be suitable to study the methods of gene therapy.