The role of the influenza A virus genotype on NF-kappaB function and phosphorylation networks

Abstract

This work is splitted in two parts, which both address the role of the IAV genotype for the function of NF-?B and host cell signaling networks. As a model system for different IAV genotypes I used an avian SC35 virus which infects avian but nu murine cells and its mouse-adapted variant SC35M which infects both avian and murine cells. In the first part the role of NF-?B for IAV infection was investigated, as the literature did not provide a clear picture. Murine MLE-15 cells were used to perturb NF-?Bsignaling either at the level of activating kinases or at the level of transcription activation. CRISPR-Cas9-mediated genome engineering was used to generate cells depleted in either the NEMO scaffold protein (and thus defective in IKK activation) or in the NF-?B DNA-binding and transactivating p65 subunit. While NF-?B was not affecting replication of SC35M, the deletion of NF-?B activity increased replication of the non-adapted SC35 virus. This antiviral effect was most noticeable upon infection of cells with low virus titers as they usually occur during the initiation phase of the IAV infection. The defect in NF-?B signaling resulted in decreased IAV-triggered phosphorylation of IRF3 and expression of the antiviral cytokine IFNß. Reassortant viruses were generated by reverse genetics system to identify the viral proteins responsible for NF-?B dependency. SC35 viruses containing the NA segment from SC35M were completely inert to the inhibitory effect of NF-?B, highlighting the importance of the viral genotype for susceptibility to the antiviral function of NF-?B.The second part of this study was performed to identify new host cell signaling pathways by a phosphoproteomic approach. MLE-15 cells were infected either with SC35 or SC35M and time dependent changes in the phophoproteome of MLE-15 cells were recorded by label-free quantitative phosphoproteome analysis. These experiments revealed thousands of IAV-regulated phosphorylation events. While approximately one-half of the inducedphosphorylations were triggered by both viruses, only one-third of the down-regulatedphosphorylations were co-regulated by SC35 and SC35M. Gene ontology and KEGG analyses revealed the overrepresentation of several pathways including those regulating cell adhesion, actin remodeling, and cytoskeleton organization. IAV-regulated kinases were identified by the occurrence of IAV-dependent changes in the activation loop and also by identification and analysis of common phosphorylation motifs, which allow the prediction of responsible kinases. These approaches disclosed the IAV-mediated regulation of FAK and inhibition of this kinase with pre-clinically used inhibitor Defactinib interfered with IAV replication. In addition, novel phosphorylation sites on IAV-encoded proteins were discovered. The functional analysis of selected phospho-sites showed that some phosphorylations serve to interfere with the enzymatic function of the viral proteins, thus providing an example for a novel antiviral signaling mechanism. Other phosphorylations supported the enzymatic function of viral proteins, opening new avenues for the therapeutic interference with IAV replication. Diese Arbeit besteht aus zwei Teilen, welche beide die Effekte des IAV Genotyps auf die Funktion von NF-?B und andere Signalwege in Wirtszellen adressieren. Als Modellsystem für verschiedene IAV Genotypen diente zum einen das aviäre SC35 Virus, welches erfolgreich aviäre Zellen infizieren kann und zum anderen die an murine Zellen adaptierte Variante SC35M, welches sowohl aviäre als auch murine Zellen infiziert.Im ersten Teil der Arbeit wurde zunächst die Rolle von NF-?B für IAV Infektionen analysiert, da die Literatur kein klares Bild lieferte. Murine MLE-15 Zellen wurden verwendet, um den NF-?B Signalweg entweder auf Ebene der Kinaseaktivierung oder auf Ebene der Transkriptionsaktivierung funktionsunfähig zu machen. Durch CRISPR-Cas9- vermittelte Genom-Editierung wurden Zellen generiert, welche entweder das Gerüstprotein NEMO nicht mehr synthetisieren (und somit eine IKK-Aktivierung verhindert wird) oder in welchen die NF-?B Untereinheit p65, welche für die Bindung an die DNA und Transaktivierung essentiell ist, fehlt. Während NF-?B die Replikation von SC35M nicht beeinflusste, hatte eine Blockierung des NF-?B Signalweges eine gesteigerte Replikation des nicht-adaptierten Virus SC35 zur Folge. Dieser antivirale Effekt konnte am deutlichsten in Zellen mit niedrigem Titer beobachtet werden, da diese normalerweise in der Initiationsphase von IAV-Infektionen auftreten. Des Weiteren resultiert ein Defekt des NF-?B Signalwegs in verminderter IAV-abhängiger Phosphorylierung sowie Expression des antiviralen Zytokins IFNß. Reassortanten der Viren wurden mittels reverser Genetik generiert um die viralen Proteine, welche für die NF-?B-Abhängigkeit verantwortlich sind, zu identifizieren. SC35 Viren, welche das NA Segment von SC35m enthalten, blieben vom inhibitorischen Effekt von NF-?B gänzlich unbeeinflusst, was die Wichtigkeit des viralen Genotyps für die Anfälligkeit der Viren gegenüber der antiviralen Funktion von NF-?B verdeutlicht.Der zweite Teil der Arbeit diente der Identifizierung neuer Signalwege in der Wirtszelle mithilfe einer Phosphoproteom-Analyse. MLE-15 Zellen wurden entweder mit SC35 oder SC35M infiziert und zeitabhängige Veränderungen des Phosphoproteoms dieser Zellen mittels quantitativer, label-freier Phosphoproteomanalyse erfasst. Diese Experimente erlaubten die Identifizierung von tausenden IAV-regulierte Phosphorylierungen in den MLE- 15 Zellen. Während ungefäht die Hälfte aller induzierten Phosphorylierungen von SC35 und SC35M hervorgerufen wurden, wurde lediglich ein Drittel der heruntergeregelten Phosphorylierungen von SC35 und SC35M ko-reguliert. Gen-Ontologie und KEGG- Analysen zeigten eine Überrepräsentation einiger Signalwege welche beispielsweise Zelladhäsion, Aktin-Remodellierung und die Organisation des Zytoskeletts regulieren. IAV- regulierte Kinasen wurden durch zwei unterschiedliche Ansätze identifiziert: Zum Einen durch das Auftreten IAV-abhängiger Veränderungen in der Aktivierungsschleife, zum anderen durch die Identifizierung von Phosphorylierungs-Motiven und den dazugehörigen Kinasen. Diese Vorgehensweise enthüllte eine IAV-vermittelte Regulation von FAK und funktionelle Studien zeigten, dass die Inhibition der Kinase durch den in prä-klinischen Studien verwendeten Inhibitor Defactinib mit der IAV-Replikation interferiert. Des Weiteren konnten bisher unbekannte Phosphorylierungsstellen von IAV-kodierten Proteinen erstmals beschrieben werden. Funktionale Analysen einiger Phosphorylierungsstellen zeigten, dass einige Phosphorylierungen mit der enzymatischen Funktion einiger viraler Proteine interferieren, was einen Beweis für neuartige antivirale Mechanismen liefert. Andere Phosphorylierungen hingegen unterstützen die enzymatische Funktion viraler Proteine, was neue Wege für therapeutische Interferenz mit der IAV-Replikation eröffnet.