Rolle der zytosolischen Phospholipase A2alpha in der Bildung Coronavirus-induzierter replikativer Organellen

Abstract

Viren mit einem Einzelstrang-RNA-Genom von positiver Polarität (+RNA-Viren) induzieren kurz nach dem Eintritt in die infizierte Wirtszelle die Bildung von großen, Organell-ähnlichen Virusfabriken , in deren Inneren der virale Replikations-/Transkriptionskomplex (RTC) verankert ist. Diese sogenannten replikativen Organellen (ROs) erlauben eine hohe lokale Anreicherung von zellulären und viralen Proteinen, welche für die virale Replikation benötigt werden. Zudem wird die virale Replikation innerhalb der ROs vor der Erkennung durch zelluläre Abwehrmechanismen geschützt. Der molekulare Mechanismus zur Bildung von ROs ist hinsichtlich der Beteiligung von spezifischen Membranstrukturen, zellulären Lipiden und Enzymen noch nicht vollständig beschrieben. Es wird jedoch aufgrund der massiven Membranumstrukturierungen im Laufe der +RNA-Virus-Infektion vermutet, dass zelluläre Enzyme, welche eine Rolle in der Lipidsynthese und/oder modifikation spielen, involviert sind. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass ein wichtiges Enzym des Lipidstoffwechsels, die zytosolische Phospholipase A2& alpha; (cPLA2& alpha;), einen Einfluss auf die Bildung Coronavirus (CoV)-induzierter ROs hat. cPLA2& alpha; katalysiert die Hydrolyse Membran-assoziierter Phosphoglyzeride an der sn2-Position, wodurch ein Lysophospholipid (LPL) sowie eine freie Fettsäure entstehen. Eine Inhibition von cPLA2& alpha; unter Verwendung des hochselektiven Inhibitors Py-2 beeinträchtigte (i) die virale RNA- und Proteinakkumulation und (ii) die Bildung viraler RTCs und ROs in CoV-infizierten Huh-7-Zellen. Der beobachtete Defekt der viralen Replikation in Py-2-behandelten Zellen legt nahe, dass die Reduktion einiger LPL-Spezies einen negativen Effekt auf die Bildung funktioneller RO-Strukturen in Virus-infizierten Zellen hat. Diese Hypothese wurde zusätzlich durch Lipidom-Analysen CoV-infizierter Zellen und weiterer Daten, welche im Laufe dieser Arbeit gewonnen wurden, unterstützt. Interessanterweise zeigt diese sowie eine weitere Studie, dass neben CoV auch die Replikation weiterer Membran-umstrukturierender +RNA-Viren durch cPLA2& alpha;-Inhibition gehemmt werden konnte. Hierzu zählten Vertreter der Flaviviridae (Hepatitis-C-Virus, Dengue-Virus; Menzel et al. 2012), Coronaviridae (MERS-CoV) und Togaviridae (Semliki-Forest-Virus). Dahingegen war die Replikation von Rhinovirus, Poliovirus, Influenzavirus und Vacciniavirus in Anwesenheit von Py-2 nicht beeinträchtigt. Zusammenfassend bietet diese Studie neue Einblicke in Coronavirus-induzierte Lipidveränderungen des Wirtszelllipidoms und konnte cPLA2& alpha; als einen essentiellen Wirtsfaktor für die Replikation von Coronaviren und weiterer +RNA-Viren aufzeigen. Letzteres bietet ebenfalls einen Ausgangspunkt für die Entwicklung eines möglichen Breitband-Virostatika. Common to all plus-strand (+) RNA viruses is the induction of intracellular membrane rearrangements that, shortly after virus entry, result in the formation of large, organelle-like virus factories to which the viral replication/transcription complexes (RTCs) are anchored. These so-called replicative organelles (ROs) ensure high local concentrations of host and viral proteins required for efficient viral replication and sequester components of the viral replication machinery from recognition by host cellular defense mechanisms. The molecular mechanisms involved in the formation of these membranous structures in virus-infected cells are not well understood and the specific roles of cellular factors, including specific membrane structures and cellular lipids, in viral replication are largely unknown. Since coronaviruses induce profound membrane rearrangements in infected cells, they have been speculated to require cellular enzymes involved in the synthesis and/or modification of specific cellular lipids. In this study, I was able to demonstrate the importance of one of these enzymes, cytosolic phospholipase A2& alpha; (cPLA2& alpha;), which could be shown to be an essential host cell factor required for the production of coronavirus-induced ROs. cPLA2& alpha; catalyzes the hydrolysis of membrane-associated phosphoglycerides at the sn-2 position, thereby generating a lysophospholipid (LPL) and a fatty acid. Furthermore, the inhibition of cPLA2& alpha; activity using a highly selective, small-molecule inhibitor (i) impairs the accumulation of viral RNA and proteins and (ii) interferes with RTC and RO formation in HCoV-229E-infected Huh-7 cells. The observed virus replication defects in cells treated with the cPLA2& alpha; inhibitor suggest that insufficient levels of LPL species produced by cPLA2& alpha; have a negative impact on the formation of fully functional RO structures in virus-infected cells. Further evidence to support this hypothesis was obtained in cellular lipidome analyses and additional studies described in this thesis. Interestingly, this and a previous study also revealed that inhibition of cPLA2& alpha; activity causes replication defects of several other +RNA viruses employing virus-induced membrane structures, such as members of the Flaviviridae (hepatitis C virus, dengue virus; Menzel et al., 2012), Coronaviridae (MERS-CoV) and Togaviridae (Semliki forest virus), while the replication of picornaviruses, influenza virus and vaccinia virus was not evidently affected in the presence of the cPLA2& alpha; inhibitor. Taken together, the study provides interesting new insight into changes of the cellular lipidome of coronavirus-infected cells and identifies cPLA2& alpha; as an essential cellular factor required for the replication of coronaviruses and several other +RNA viruses, potentially providing new options for the development of broadly acting antiviral drugs.