Disulfide-dithiol exchange in thioredoxin-dependent reactions of Plasmodium falciparum and its human host cells

Abstract

Specific protein cysteine residues can serve as structural components, catalysts, or redox switches. In peroxiredoxins (Prx), cysteines facilitate the enzymes ability to reduce peroxides by forming intra- or intermolecular disulfide bridges and transient mixed disulfides. Within the framework of my thesis, I aimed to further understand the underlying molecular processes. To characterize the role of specific, catalytically active cysteines during the recycling step of the catalytic cycle of Prxs, a surface plasmon resonance-based method was developed. With this new approach, which shows particular advantages over other methods investigating protein-protein interactions (PPIs), the regioselectivity of Plasmodium falciparum (Pf) thioredoxin (Trx) to recycle disulfides at active site cysteines of PfPrxs was characterized in molecular detail. The data generated were confirmed with electrophoretic mobility shift assays on a selected, representative interaction couple. To compare the SPR-based approach with other methods currently used for studying PPI, isothermal titration calorimetry and microscale thermophoresis were conducted with selected PPI partners. Comparing these three methods revealed the SPR-based approach as clearly preferable to ITC and MST in answering the leading question. Additionally, within this thesis the thiol-dependent interactomes of PfPrx1a and PfPrx1m were revealed using a pull-down assay. In the applied assay, 2-Cys Prxs and their mutants lacking the resolving or peroxidatic cysteines were used as bait to identify potential interacting partners. With this, 127 proteins were found to interact with PfPrx1a and 20 proteins with PfPrx1m via a mechanism involving disulfide bound formation. Based on bioinformatic and bibliographic analyses, the proteins identified components of various metabolic pathways such as carbohydrate metabolism, protein folding, the translational machinery, S-adenosylmethionine metabolism, signal transduction, and others. These results provide new insights into the regulatory mechanism of Prx-mediated redox biology in Plasmodium falciparum and many new candidate targets for oxidation signal transduction by PfPrxs. Furthermore, proteins caught with resolving cysteine mutants may allow the innovative pronouncement of an additional function of Prxs as proteins that are capable of reducing oxidized proteins. This follows a catalytic process similar to peroxide reduction using the second active site cysteine to resolve the transient mixed disulfide between Prx and the targeted protein. In most cells, the thioredoxin (Trx) and glutathione systems are essentially involved in maintaining redox homeostasis in a thiol-dependent mechanism. The selenoprotein thioredoxin glutathione reductase (TGR) is a hybrid enzyme in which a glutaredoxin (Grx) domain is linked to a thioredoxin reductase (TrxR) and which is also capable of reducing glutathione disulfide (GSSG), thus representing an important link between the two redox systems. In this thesis, human TGR (hTGR wild type) was recombinantly produced by fusing its open reading frame with a bacterial SECIS element and co-expressing the construct in E. coli together with the selA, selB, and selC genes. Additionally, the Sec→Cys mutant (hTGRU642C) of the full-length protein as well as the isolated TrxR domain (hTGR151-642) and the Grx domain containing a monothiol active site (hTGR1-150) were produced and purified. All four proteins were kinetically characterized in direct comparison using Trx, DTNB, HEDS, or GSSG as oxidizing substrates. Interestingly, the HEDS reduction activity was Sec independent and comparable in the full-length protein and the isolated Grx domain, whereas the TrxR and the glutathione reductase(GR) reactions were clearly Sec-dependent, with the GR reaction requiring the Grx domain. Site-directed mutagenesis studies revealed novel insights into the mechanism of GSSG reduction. Furthermore, several glutathionylation sites in hTGR were identified with an inhibitory effect of these modifications on enzyme activity. In contrast to other TGRs, e.g. from platyhelminth parasites, hTGR did not exhibit hysteretic behavior. These findings provide new insights into the reaction mechanism and regulation of monothiol Grx containing TGRs. In Proteinen können spezifische Cysteinreste als strukturelle Komponenten, Katalysatoren oder Redoxschalter fungieren. In Peroxiredoxinen (Prx) vermitteln Cysteine die Peroxidasefunktion des Enzyms, was zur Entstehung von intra- oder intermolekularen Disulfidbrücken aber auch zu transienten, gemischten Disulfiden führt. Im Rahmen meiner vorliegenden Arbeit galt das Ziel diese zugrundeliegenden Prozesse tiefer zu verstehen. Um die Rolle von spezifischen, katalytisch-aktiven Cysteinen in dem Prx-Recyclingschritt zu charakterisieren, wurde eine Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-basierte Methode entwickelt. Mit dieser Methode, welche explizite Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Protein-Protein-Interaktions (PPI)-Bestimmung aufzeigt, konnte die Regioselektivität von Plasmodium falciparum (Pf) Thioredoxin (Trx) im Recyclingprozess gegenüber Disulfiden des aktiven Zentrums von PfPrx auf molekularer Ebene aufgezeigt werden. Zudem konnten die generierten Daten an einem ausgewählten, repräsentativen Beispiel durch Electrophoretic Mobility Shift Assays bestätigt werden. Um die SPR-basierte Methode mit bereits bestehenden Methoden der PPI-Bestimmung zu vergleichen, wurde mit ausgewählten PPI-Partnern ebenfalls die isothermale Titrationskalorimetrie und Microscale Thermophorese durchgeführt. Der Vergleich dieser drei Methoden zeigt dabei eindeutig, dass die SPR-basierte Methode für die zugrundeliegende Fragestellung zu bevorzugen ist. Des Weiteren konnte in dieser Thesis mittels eines Pull-down Verfahrens das Thiol-abhängige Interaktom von PfPrx1a sowie PfPrx1m dargestellt werden. In dem verwendeten Verfahren wurden 2-Cys Prxs sowie deren resolving Cystein- und peroxidatic Cystein-Mutanten als Fänger genutzt, um potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Hierbei konnten 127 Proteine gefunden werden, die über einen Disulfid-involvierten Mechanismus mit PfPrx1a interagieren und 20 Proteine, welche mit PfPrx1m wechselwirken. Durch bioinformatische und bibliographische Analysen konnten diese Proteine verschiedenen metabolischen Stoffwechselwegen, wie dem Kohlenhydratstoffwechsel, der Proteinfaltung, der Translationsmaschinerie, dem S-Adenosylmethioninmetabolismus, der Signaltransduktion und anderen, zugeordnet werden. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in den regulatorischen Mechanismus der Prx-vermittelten Redoxbiologie in Plasmodium falciparum sowie viele neue Kandidatenproteine für eine Oxidationssignalübertragung durch PfPrxs. Weiterhin könnten Proteine, welche mit den resolving-Mutanten gefangen wurden, die Hypothese stützen, dass Prxs eine zusätzliche Funktion inne tragen. Demnach könnten Prxs in der Lage sein, oxidierte Proteine zu reduzieren, indem sie einem katalytischen Prozess ähnlich der Peroxidreduktion folgen, wobei das zweites Cystein im aktivem Zentrum genutzt wird, um das transiente, gemischte Disulfid zwischen dem Prx und seinem Zielprotein zu lösen. In den meisten Zellen sind das Thioredoxin- (Trx) und das Glutathion-System essenziell in die Aufrechterhaltung der Redoxhomöostase in einem Thiol-abhängigen Mechanismus involviert. Das Selenoprotein Thioredoxin-Glutathion-Reduktase (TGR) ist ein Hybrid-enzym, in welchem eine Glutaredoxin (Grx)-Domäne mit einer Thioredoxinreduktase (TrxR) verknüpft ist, und das zudem in der Lage ist, Glutathiondisulfid (GSSG) zu reduzieren, womit es eine bedeutende Verbindung zwischen zwei Redoxsystemen darstellt. In dieser Thesis wurde die humane TGR (hTGR Wildtyp) rekombinant hergestellt, indem sein offener Leserahmen mit einem bakteriellen SECIS-Element fusioniert wurde und das Konstrukt in E. coli zusammen mit selA, selB und selC Genen koexpremiert wurde. Zudem wurden die Sec→Cys Mutante (hTGRU642C) des Proteins sowie die isolierte TrxR-Domäne (hTGR151-642) und die Grx-Domäne (hTGR1-150), welche ein Monothiol im aktiven Zentrum beinhaltet, hergestellt und gereinigt. Alle vier Proteine wurden im direkten Vergleich durch die Verwendung von Trx, DTNB, HEDS oder GSSG als oxidierende Substrate kinetisch charakterisiert. Interessanterweise war die HEDS-Reduktions-Aktivität Sec-unabhängig und zeigte sich vergleichbar in dem Volllängenprotein und der isolierten Grx-Domäne, wobei die TrxR- und die Glutathionreduktase(GR)-Reaktion eindeutig eine Sec-abhängigkeit zeigten und die GR-Reaktion die Anwesenheit der Grx-Domäne benötigte. Ortsgerichtete Mutagenesestudien lieferten hierbei neuartige Einblicke in den Mechanismus der GSSG-Reduktion. Weiterhin konnten mehrere Glutathionylierungsstellen in der hTGR identifiziert und ein inhibierender Effekt durch diese Modifikationen festgestellt werden. Im Gegensatz zu anderen TGRs, z.B. aus Platyhelminthen, weist die hTGR kein hysteretisches Verhalten auf. Diese Ergebnisse ermöglichen neue Einblicke in den Reaktionsmechanismus und die Regulation von Monothiol-Grx-beinhaltenden TGRs.