Charakterisierung der Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Identifizierung und biochemische Charakterisierung von p120ctn als Interaktionspartner der Rho-GTPasen RhoA und RhoC in vitro und in der humanen Pankreaskarzinomzelllinie PANC-1 untersucht. p120ctn ist ein armadillo repeat-Protein aus der Familie der p120ctn Proteine und stabilisiert durch seine Bindung an die zytoplasmatische Domäne von E-Cadherin den für die Zell-Zell-Adhäsion wichtigen Cadherin-Catenin-Komplex an adherens junctions. Auf die Interaktion von p120ctn mit Cadherinen nehmen u. a. die Rho-GTPasen RhoA und RhoC Einfluss, die Mitglieder der Ras-Superfamilie sind und eine Aminosäuresequenzidentität von 92 % aufweisen. Castano und seine Mitarbeiter konnten bereits eine Interaktion von p120ctn mit RhoA nachweisen und die Bindungsdomäne auf p120ctn für RhoA auf den Aminosäuresequenzbereich 101-234 eingrenzen. In der Arbeitsgruppe von K. Giehl konnte erstmals eine Interaktion von RhoC mit p120ctn dokumentiert werden und eine unterschiedlich große Affinität der beiden Rho-GTPasen RhoA und RhoC gegenüber p120ctn festgestellt werden, was auf eine unterschiedliche Aminosäure auf Position 152 bei RhoC zurückzuführen ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine spezifische Methode zur vergleichenden Analyse der Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC zu entwickeln und die Bindungsdomäne auf p120ctn weiter einzugrenzen. Hierfür wurde zunächst das GST-µMACS-System verwendet, welches aufgrund einer zu geringen Präzipitation von p120ctn für eine Co-Immunpräzipitation von Rho nicht geeignet war. Mit Hilfe des GST-Glutathion-Sepharose-Systems konnte eine Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC bestätigt werden. Außerdem konnte erstmals die Bindungsdomäne von p120ctn für RhoC auf den Aminosäuresequenzbereich 101-234 eingegrenzt werden. Bei den durchgeführten Experimenten mit dem GST-Glutathion-Sepharose-System zeigte sich jedoch ebenfalls eine unerwünschte Interaktion zwischen Rho und GST, die auch durch zahlreiche Variationen der Versuchsbedingungen nicht eliminiert werden konnte, sodass weitere Versuchssysteme analysiert wurden. Es wurden Interaktionsstudien mit Protein G-Agarose und einem anti-GFP-Antikörper durchgeführt, um die Präzipitationsreihenfolge von p120ctn und den Rho-GTPasen zu verändern, was nicht zu einem Nachweis der Interaktion führte. Aufgrund einer unspezifischen Bindung von p120ctn an den Rho-Antikörper und die Protein A µMACS-Beads war jedoch auch dieses Versuchssystem nur bedingt geeignet. Außerdem wurden Versuchssysteme mit einem anti-HA (12CA5) Antikörper und HA-markierten Rho-GTPasen angewendet, die zwar zum Nachweis einer Interaktion zwischen p120ctn und den Rho-GTPasen führten, aber ebenfalls unspezifische Protein-Interaktionen aufwiesen. Schließlich wurden erstmalig aufgereinigte GST-Rho-Fusionsproteine im GST-µMACS-System eingesetzt und hiermit konnte die Interaktion zwischen p120ctn und RhoA bzw. RhoC bestätigt und eine höhere Bindungsaffinität von RhoC gegenüber p120ctn(1A) als RhoA nachgewiesen werden. Der Aminosäuresequenzbereich auf p120ctn konnte mit Hilfe des GST-µMACS-Systems für RhoA und RhoC auf 101-234 eingegrenzt werden. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit die Komplexität, ein ausreichend sensitives und reproduzierbares Versuchssystem unter Berücksichtigung der zahlreichen auf ein Experiment einflussnehmenden Faktoren zu etablieren. Eine Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC konnte bestätigt werden und die Bindungsdomäne auf p120ctn auf den Aminosäuresequenzbereich 101-234 eingegrenzt werden. This dissertation investigates the identification and biochemical characterization of p120ctn as an interaction partner of the Rho GTPases RhoA and RhoC in vitro and in the human pancreatic carcinoma cell line PANC-1. p120ctn is an armadillo repeat protein from the family of p120ctn proteins and, through its binding to the cytoplasmic domain of E-cadherin, it stabilizes the cadherin-catenin complex on adherens junctions, which is important for cell-cell adhesion. The Rho GTPases RhoA und RhoC influence the interaction of p120ctn with cadherins. RhoA and RhoC are members of the Ras superfamily with an amino acid sequence identity of 92 %. Castano and his team were already able to detect an interaction of p120ctn with RhoA and to narrow the binding domain to p120ctn for RhoA to the amino acid sequence range 101-234. In the team of K. Giehl, an interaction of RhoC with p120ctn has been documented for the first time and a different affinity of the two Rho GTPases RhoA and RhoC against p120ctn could be determined, which is due to a different amino acid at position 152 in RhoC. The aims of the dissertation were first, to develop a specific method for the comparative analysis of the interaction of p120ctn with the Rho GTPases RhoA and RhoC and second, to further narrow the binding domain to p120ctn. For this purpose, the GST-µMACS system was initially used. However, this was not suitable for co-immunoprecipitation of Rho due to too low precipitation of p120ctn. Using the GST-Glutathion-Sepharose system, an interaction of p120ctn with the Rho GTPases RhoA and RhoC was confirmed. In addition, for the first time the binding domain of p120ctn for RhoC was limited to the amino acid sequence range from 101-234. However, the experiments performed with the GST-Glutathion-Sepharose system revealed an undesirable interaction between Rho and GST, which could not be eliminated despite numerous variations of the experimental conditions. As such further experimental systems were analyzed. Interaction studies were performed with protein G agarose and an anti-GFP antibody to alter the precipitation order of p120ctn and the Rho GTPases. This did not result in confirming the interaction. However, due to an unspecific binding of p120ctn to the Rho antibody and the protein A µMACS beads this experimental system was only partially suitable. In addition, experimental systems were used with an anti-HA (12CA5) antibody and HA-tagged Rho GTPases, which, while demonstrating an interaction between p120ctn and the Rho GTPases, also exhibit non-specific protein interactions. Finally, purified GST-Rho fusion proteins were used for the first time in the GST-µMACS system, confirming the interaction between p120ctn and RhoA or RhoC and demonstrating a higher binding affinity of RhoC than RhoA to p120ctn(1A). The amino acid sequence range on p120ctn could be narrowed to 101-234 using the GST-µMACS system for RhoA and RhoC. In summary, this dissertation demonstrates the complexity of establishing a sufficiently sensitive and reproducible experimental system, taking into account the numerous factors influencing an experiment. An interaction of p120ctn with the Rho GTPases RhoA and RhoC could be confirmed and the binding domain to p120ctn restricted to the amino acid sequence range 101-234.