Testicular neoplasia: functional polarization of macrophages and dendritic cells

Abstract

In this study, tissue specimens of normal, non-inflamed human testis with intact spermatogenesis and testicular germ cell neoplasia (GCNIS, seminoma) containing immune cell infiltrations were analysed by immunohistochemistry, immunfluores-cence and qRT-PCR to reveal phenotypic and functional differences among the immune cells that are contributing to the respective environment, reflected by cytokine expression profiles. The focus is set on macrophages and dendritic cells. Using specific macrophage and dendritic cell (DC) markers, different subsets of these immune cell types were identfied in testicular germ cell neoplasia suggesting a functional polarization. Under physiological conditions in the testis, anti-inflammatory M2 macrophages as supported by the presence of TGF-beta and IL-10 have been detectable, whereas DCs that express CD11c were rare. In contrast, GCNIS (known as precursor of seminoma) and seminoma was associated with infiltration of different DC subsets, i.e. mDC and pDC. A detailed analysis of macrophages revealed that, pro-inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages are involved in immune cell infiltrates associated with testicular germ cell neoplasia. In line with the detection of M1 macrophages, increased levels of trancripts encoding IL-12 and TNF-alpha were found in neoplasia. To delinate why both, anti- and pro-inflammatory macrophages could be associated with testicular cancer, chemokines as well as potential macrophage polarization factors were analysed. A detailed chemokine expression profile revealed CCL2, CCL5, CCL18 and CCL22 as well as TGF-beta1, TNF-alpha and IL-6 as potential macrophage polarization factor to be associated with GCNIS and seminoma. To understand how these factors influence macrophages regarding their migration and differentiation/ polarization, an in vitro cell culture model using human monocyte derived THP-1 cells was estabilished. The results obtained indicate that CCL2 and CCL5 recruit macrophages and also influence macrophage polarization. To test whether tumour cells could drive macrophage differentiation, a co-culture model was estabilished using a human seminoma cell line (TCam-2) and THP-1 cells that were differentiated into M0, M1 and M2 macrophages. The co-culture of M0 and M1 macrophages with TCam-2 revealed a functional polarization of the THP-1-derived cells into an immunosuppressive M2 phenotype that may be driven by TGF-beta1, IL-6 and CCL2. TGF-beta1 signalling pathway inhibitor blocked the polarization towards an immunosuppressive M2 phenotype. Furthermore, a functional assessment of THP-1-derived M0 and M1 macrophages was conducted to reveal potential tumoricidial activities. In a phagocytosis assay, M1 macrophages showed high phagocytic activity enabling these cells to reduce TCam-2 cell numbers in the co-culture model. However, TCam-2 cells are likely to escape the tumoricidal activity by driving these macrophages into an immunosuppressive phenotype. In conclusion, M2 macrophages are the dominating immune cell population that support tumour grow. Therefore, as clinical outcome an inhibition of typical M2 polarization factors should be considered rather than an inhibition of recruitment factors (chemokines) since this would also influence the recruitment of phagocytic, tumour suppressive M1 macrophages. Future work should address the role of specific immune modulators, such as TGF-beta and activin A, and the impact and regulation of macrophage phagocytic activity on tumour cell survival and proliferation. Thus, potential macrophage differentiation inhibitors should be considered, as therapeutics to reinforce strong immune reactions against tumour cells. In dieser Studie wurden humane Hodenbiopsien mit normaler Spermatogenese oder Hodenneoplasien (GCNIS, Seminom) mit lymphatischen Infiltraten mittels Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz und qRT-PCR analysiert. Funktional unterschiedliche Immunzellen (Makrophagen und dendritische Zellen) wurden durch jeweilige Zytokinexpressionsprofile in den unterschiedlichen Milieus identifiziert.Unter Verwendung von spezifischen Makrophagen- und dendritischen Zellmarkern wurden verschiedene Immunzellsubtypen mit völlig anderen Funktionen in Neopla-sie-Proben identifiziert. In den Hoden unter physiologischen Bedingungen waren entzündungshemmende M2-Makrophagen nachweisbar, die durch das Vorhandensein von spezifischen Marker wie CD163 und CD206 sowie anti-inflammatorischen Zytokinen, TGF-beta und IL-10 nachgewiesen wurden. DCs, die CD11c exprimieren, waren kaum detektierbar. Im Gegensatz dazu waren in GCNIS Proben (als Vorstufe von Seminomen bekannt) verschiedene DC Subtypen detektierbar, mDC und pDC. In Seminomen wurden diese Immunzellen mit einer höheren Frequenz nachgewiesen. Eine detaillierte, funktionelle Analyse der DC-Subtypen war jedoch aufgrund ihrer anspruchsvollen Vielfalt in dieser Arbeit nicht möglich und muss weiter analysiert werden. Eine detaillierte Makrophagen-Analyse im Zusammenhang mit Neoplasien ergab, dass proinflammatorische M1 Makrophagen, IL-12 und TNF-alpha exprimieren und das aber auch antiinflammatorische M2 Makrophagen präsent waren. Eine halbquantitative Bewertung der einzelnen Makrophagen spezifischen Marker ergab, dass eine Balance von beiden, M1 und M2 Makrophagen in Neoplasien vorherrscht. Um zu verstehen, warum entzündungshemmende sowohl als auch proinflammatorische Makrophagen mit Hodenkrebs in Verbindung gebracht werden, analysierten wir Chemokine, die für ihre Funktionen zur Rekrutierung von Immunzellen sowie als potentielle Makrophagen Polarisationsfaktoren bekannt sind. Ein detailliertes Chemokinprofil zeigte, dass die Chemokine CCL2, CCL5, CCL18 und CCL22 nachweisbar waren sowie andere potentielle Makrophagen-Polarisationsfaktoren, TGF-beta1, TNF-alpha und IL-6 mit testikulären Neoplasien (GCNIS und Seminom) assoziiert sind. Um zu verstehen, wie diese Faktoren Makrophagen in Bezug auf ihre Migration und Differenzierung beeinflussen, entwickelten wir ein In vitro-Zellkulturmodell mit humanen Monozyten (THP-1-Zellen). Unsere Ergebnisse zeigen, dass CCL2 und CCL5 Makrophagen rekrutieren und auch die Makrophagen polarisation beeinflussen. Um zu verstehen, warum Tumorzellen eine immunsupressive Makrophagen-Differenzierung begünstigen, wurde ein Co-Kulturmodell unter Verwendung von humanen Seminoma Zellen (TCAM-2) und humanen Monozyten (THP-1-Zellen), die zuvor in M0, M1 und M2 Makrophagen differenziert wurden, entwickelt. Die Co-Kultivierung von M0- und M1-Makrophagen mit TCam-2 offenbarte eine funktionelle Polarisierung dieser Makrophagen zu einem immunsuppressiven M2-Phänotyp, der durch TGF-beta1, IL-6 und CCL2 gesteuert werden kann. Jedoch blockierte der TGF-beta1-Signalweg-Inhibitor die Polarisation in Richtung eines immunsuppressiven M2 Phänotyp. Zusätzlich wurde eine funktionelle Bewertung von M0 und M1 Makrophagen durchgeführt, um potentielle tumorizide Aktivitäten aufzudecken. Dazu wurde ein Phagozytose-Assay etabliert und zeigte M1-Makrophagen als hoch phagozytische Zellen, die die Anzahl der TCam-2-Zellen in unserem Co-Kultur-Modell reduzieren könnte. Ungünstigerweise treiben TCam-2 diese Makrophagen in einen immunsuppressiven Phänotyp, der das Wachstum von Tumorzellen durch Phagozytose nicht kontrollieren kann.Zusammenfassend kann gesagt werden, dass M2-Makrophagen die dominierende Immunzellenpopulation, die das Tumorwachstum begünstigen sind. Als klinisches Outcome sollte daher eher eine Inhibition typischer M2-Polarisationsfaktoren als eine Hemmung von Rekrutierungsfaktoren (Chemokinen) in Betracht gezogen werden, da andernfalls auch die Rekrutierung von phagozytischen, tumorsuppressiven M1-Makrophagen beeinflusst werden würde. Zukünftige Arbeiten sollten die Rolle von spezifischen Immunmodulatoren wie TGF-beta und activin A sowie den Einfluss und die Regulierung der Phagozytoseaktivität von Makrophagen untersuchen um somit die Proliferation von Tumorzellen zu inhibieren. Daher sollten potentielle Makrophagen-Differenzierungshemmer als Therapeutika zur Verstärkung von Tumor suppressiven Immunreaktionen in Betracht gezogen werden.