Der Einfluss der alpha9- und alpha10-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors auf den Knochenstoffwechsel

Abstract

Die Beschreibung der Komponenten des cholinergen Systems im Knochen und die Expression von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) mit den Untereinheiten alpha9 und alpha10 in murinen und humanen Osteoblasten-ähnlichen Zellen bilden die Basis dieser Arbeit (En-Nosse et al., 2009; Sato et al., 2010). Die Zusammensetzung von nAChR aus alpha9- und alpha10-Untereinheiten kann als alpha9-Homopentamer oder alpha9alpha10-Heteropentamer erfolgen. Der Nachweis einer verminderten Expression von nAChR alpha10 in Osteoblasten von Patientinnen mit Osteoporose (Zablotni et al., 2015) zeigt die Relevanz der Charakterisierung der Funktion der jeweiligen Untereinheit im Knochenremodeling.Die Knochen von jeweils acht weiblichen, adulten Knockout-(KO) Mäusen mit einer Deletion der nAChR alpha9 oder alpha10 wurden im Vergleich zu ihren korrespondierenden Wildtyp-(WT)-Tieren folgenden Untersuchungen unterzogen: Drei-Punkt-Biegetest, Mikro-Computertomographie (mikroCT), Histologie, Enzym- und Immunhistochemie, real- time Reverse Transkriptase Polymerase-Ketten-Reaktion, Transmissionselektronen- mikroskopie (TEM).Im Drei-Punkt-Biegetest zeigte sich eine reduzierte biomechanische Belastbarkeit des Femurs der alpha9KO- im Vergleich zu den alpha9WT-Mäusen, während sich die Parameter Biegesteifigkeit und Maximalkraft der Knochen der alpha10-Tiere nicht voneinander unterschieden. Verminderte Werte der Calciumhydroxylapatitdichte (TMD) und der geometrischen Parameter (Ct.Ar, Tt.Ar) der Kortikalis wurden in zwei verschiedenen Bereichen der Femurdiaphyse der alpha9KO-Tiere im mikroCT gemessen. Im Trabekelwerk des Lendenwirbelkörpers und der distalen Femurmetaphyse der alpha9KO-Mäuse wurden ein Abfall der trabekulären Dicke (Tb.Th) und ein Anstieg der Parameter bone surface/bone volume (BS/BV), trabecular pattern factor (Tb.Pf) und structure model index (SMI) nachgewiesen. Auf zellulärer Ebene wurde eine Reduktion der mRNA-Expression von Collagen1alpha1 und Connexin43 der alpha9KO-Tiere gemessen. Eine Veränderung der Parameter für Osteoklasten lag weder bei alpha9KO- noch alpha10KO-Tieren vor. Bei der Untersuchung der Ultrastruktur der Osteozyten in der TEM wurde eine erhöhte Anzahl degenerierender und sterbender Osteozyten in der Gruppe der alpha9KO- im Vergleich zur Gruppe der alpha9WT-Mäuse beobachtet. Die Ultrastruktur der Osteozyten der alpha10KO- Mäuse unterschied sich nicht von ihren Kontrolltieren.Die Knochen der alpha9KO-Mäuse präsentierten Veränderungen der biomechanischen Kompetenz, der Knochenstruktur und der Expression von Markern für Osteoblasten sowie Osteozyten. In Abwesenheit von alpha9 wurde der Beginn einer morphologischen Degeneration der Osteozyten sowie eine Reduktion der Expression von Connexin43 und Collagen1alpha1 beobachtet. Veränderungen der Connexin43 Expression beeinflussen die Vitalität der Osteozyten sowie ihre Funktionen bei der Mechanotransduktion und Kommunikation. In der Folge könnte dies zusammen mit der Reduktion der Collagenexpression in den Osteoblasten der alpha9KO-Tiere die Basis für die beobachtete Minderung der kortikalen Mineralisierung und die Veränderung der trabekulären Architektur bilden. Letztlich wirkt sich eine alpha9-Deletion auf die qualitativen und quantitativen Eigenschaften der Knochenmatrix sowie auf die biomechanische Belastbarkeit der Knochen aus. Eine Regulation der Biomechanik, Morphologie und Mineralsalzdichte der kortikalen und spongiösen Knochenareale der alpha10KO-Tiere konnte nicht gezeigt werden. Ebenso lag kein Hinweis auf den Einfluss der nAChR alpha9 und alpha10 auf die Anzahl und Aktivität von Osteoklasten vor. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten auf einen Einfluss der nAChR, welche alpha9-Untereinheiten beinhalten, bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Osteozyten und Osteoblasten hin, die für den feinregulierten Ablauf von Remodeling und Mineralisierung essenziell sind. The description of the components of the cholinergic system in bone and the expression of nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) containing subunits alpha9 and alpha10 in murine and human osteoblast-like cells form the basis of this work (En- Nosse et al., 2009; Sato et al., 2010). nAChR alpha9 and alpha10 subunits can be composed as alpha9-homopentamer or alpha9alpha10-heteropentamer. The detection of reduced expression of nAChR alpha10 in osteoblasts of patients with osteoporosis (Zablotni et al., 2015) demonstrates the relevance of the characterization of nAChR subunits.The following tests were performed for bones from each of eight adult female knockout (KO) mice with a deletion of nAChR alpha9 or alpha10 in comparison to their corresponding wild-type (WT) animals: three-point bending test, micro-computed tomography (microCT), histology, enzyme and immunohistochemistry, real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and transmission electron microscopy (TEM).The three-point bending test showed a reduced biomechanical bending stiffness and maximal breaking force of the alpha9KO femur compared to alpha9WT, while the biomechanical parameters of the alpha10 animals were indistinguishable. Reduced values of tissue mineral density (TMD) and cortical geometric parameters (Ct.Ar, Tt.Ar) were measured in two different areas of the alpha9KO femoral diaphysis in microCT. Also, a decrease in trabecular thickness (Tb.Th) and an increase bone surface/bone volume (BS/BV), trabecular pattern factor (Tb.Pf) and structure model index (SMI) were detected in trabecular bone of the lumbar vertebrae as well as the distal femoral metaphysis of the alpha9KO. On the cellular level, mRNA expression of collagen1alpha1 and connexin43 of alpha9KO was reduced. There was no change in osteoclast parameters for either alpha9KO or alpha10KO. The evaluation of the ultrastructure of osteocytes in TEM showed an increased number of degenerating and dying osteocytes in the group of alpha9KO compared to the group of alpha9WT. The ultrastructure of alpha10KO osteocytes did not differ from their control animals.Bones of alpha9KO mice presented changes in biomechanical properties, bone structure and expression of markers for osteoblasts and osteocytes. In the absence of alpha9, the onset of morphological degeneration of the osteocytes and a reduction of the expression of connexin43 and collagen1alpha1 were observed. Changes in connexin43 expression are known to alter the vitality of osteocytes as well as their functions in mechanotransduction and communication. These findings, combined with the reduction in collagen expression inalpha9KO osteoblasts, could provide the basis for the reduction of cortical mineralization and change in trabecular architecture. Finally, a deletion of the subunit alpha9 affects the qualitative and quantitative properties of bone matrix as well as the biomechanical resilience of bones. An alteration of the biomechanics, morphology and mineral salt density of the cortical and cancellous bone in alpha10KO animals could not be demonstrated. Additionally, there was no indication of influence of nAChR alpha9 and alpha10 on osteoclastic numbers and activity. The results of the present study suggest a regulating effect of nAChR, which contain alpha9 subunits, in maintaining homeostasis of osteocytes and osteoblasts, which are essential for the well-functioning course of remodeling and mineralization.