Einsatz von künstlichen Sialinsäuren zur Anwendung gegen Influenza-A-Viren

Abstract

Auf der Zelloberfläche modulieren Sialinsäuren Zell-Zell- und Zell-Molekül-Interaktionen. In der endständigen Position oberflächlicher Glykoproteine und Glykolipide nehmen Sialinsäuren im Rahmen des viralen Replikationszyklus eine Schlüsselrolle ein. Die Substratpermissivität verschiedener Enzyme in der Sialinsäurebiosynthese erlaubt die chemische Veränderung sialinsäuretragender Glykokonjugate. Ziel dieser Arbeit war es, künstlich sialylierte Glykokonjugate anzureichern und diese als potentielle Virostatika zu untersuchen. Die hergestellten peracetylierten ManNAc-Analoga, OAc4-ManNProp und OAc4-ManNBut, dienten der Inkubation von A549-Zellen, wobei es möglich war, bis zu 72 % der natürlichen Sialinsäuren durch künstlich veränderte zu ersetzen. Es wurde unter verschiedenen Parametern ein Protokoll entwickelt, das gestattet, etwa die Hälfte der Sialinsäuren durch künstliche zu ersetzen und dabei gleichzeitig ermöglicht, eine erhebliche Stoffmenge an Sialinsäuren für weitere Versuche zu synthetisieren. Getestete Neuraminidasen verschiedener Influenza-A-Viren spalteten die natürlichen Sialinsäuren von A549-Zellsuspensionen, hatten aber deutliche Schwierigkeiten in der Umsetzung der künstlichen Konjugate mit Neu5Prop und Neu5But. Um eine mögliche inhibierende Wirkung der modifizierten Glykokonjugate gegenüber dem Influenza-A-Virus zu studieren, wurde weiterführend ein Protokoll entwickelt, das der Anreicherung der künstlich veränderten sialylierten Glykokonjugate mittels Anionenaustauschersäule diente. Die hergestellten Glykokonjugate zeigten in allen virologischen Versuchen einen inhibitorischen Effekt gegenüber dem Influenza-A-Virus. Dabei war der Effekt der künstlichen Glykokonjugate, die natürliche sowie künstliche Sialinsäuren enthielten, gegenüber den natürlichen Glykokonjugaten in allen Versuchsreihen stärker ausgeprägt. Die Aktivität der Neuraminidase wurde durch alle Präparate gesenkt. Zudem reduzierten die Präparate in den Versuchen der Einzelzyklus- und Multizyklus-Replikation des Influenza-A-Virus die Infektion von MDCK-Zellen bzw. Calu-3-Zellen. In den Versuchen der multizyklischen Replikation konnte das Präparat mit der künstlichen Sialinsäure Neu5Prop im Vergleich zu Oseltamivircarboxylat und den anderen getesteten Substanzen die beste Wirkung erzielen. Die gewonnenen Daten zeigen, dass die Verlängerung der N-Acylseitenkette an Sialinsäuren von Glykokonjugaten erheblichen Einfluss auf das Influenza-A-Virus hat und eine Steigerung des inhibitorischen Effekts der Konjugate bewirkt. Neben einer inhibierenden Wirkung gegenüber der Neuraminidase, ist auch eine Blockade der Hämagglutinin-Bindestellen wahrscheinlich. Sialic acids modulate cell-cell and cell-molecule interactions on the cell surface. On the terminal position of oligosaccharide chains on superficial glycoproteins and glycolipids, sialic acids play a key role in the viral replication cycle. The substrate permissivity of various enzymes in sialic acid biosynthesis enables chemical modification of glycoconjugates carrying sialic acids. The aim of this study was to enrich artificially sialylated glycoconjugates and to investigate them as potential antivirals. The peracetylated ManNAc analogs, OAc4-ManNProp and OAc4-ManNBut, were applied to A549 cells, which enabled replacement of up to 72 % of the natural sialic acids with artificially modified ones. Using various parameters, I developed a protocol allowing the exchange of approximately 50 % of all sialic acids with artificial sialic acid residues. Simultaneously, it thereby provides the opportunity to synthesise a considerable amount of sialic acids for further experiments. While tested neuraminidases of various influenza A viruses cleaved the natural sialic acids of A549 cell suspensions, they showed reduced capacities to release Neu5Prop and Neu5But residues. In order to study a possible inhibitory effect of the modified glycoconjugates against the influenza A virus in more detail, a protocol was developed, which allowed an enrichment of artificially modified sialylated glycoconjugates using an anion exchange column. The produced glycoconjugates showed an inhibitory effect against the influenza A virus in all virological experiments. The effect of the artificial glycoconjugates, which contained both natural and artificial sialic acids, was superior to the natural glycoconjugates in all experiments. The neuraminidase activity was reduced by all substances. In addition, in the single cycle and multicycle influenza A virus replication studies, the substances showed reduced infection of MDCK cells and Calu-3 cells, respectively. In experiments of multicycle virus replication, the preparation containing artificial sialic acid Neu5Prop showed the best effect in comparison with oseltamivir carboxylate and the other substances tested. The data suggest that the extension of the N-acyl side chain in sialic acid residues of glycoconjugates has an impact on the influenza A virus and increases the inhibitory effect of the applied glycoconjugates. In addition to its inhibitory properties on neuraminidase, a blockade of haemagglutinin binding sites is likely.