Rac1b-spezifische Effekte und Auswirkungen der 3D-Kultivierung auf Differenzierung und Signaltransduktion in NSCLC-Zelllinien

Abstract

Die Rho-GTPase Rac1 und seine Spleiß-Isoform Rac1b sind in vielen humanen, nicht-kleinzelligen Lungentumoren (NSCLC) überexprimiert. Aufgrund der hohen Sequenzhomologie wurde jedoch in vielen Studien nicht zwischen diesen beiden Rac-Isoformen unterschieden, weswegen bisher kaum Rac1b-spezifische Funktionen bekannt sind. Rac1b enthält ein zusätzliches Exon 3b, was in einer 19 Aminosäure-langen Insertion resultiert. Dadurch liegt Rac1b hauptsächlich in seinem aktiven, GTP-gebundenen Zustand vor. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Rac1b auf die Proliferation, den Differenzierungs-status, die Migrationsfähigkeit und die Genregulation untersucht. Hierfür wurde die Lungen-adenokarzinom-Zelllinie H23 verwendet, die transient oder stabil EGFP, EGFP-Rac1 bzw. EGFP-Rac1b exprimierte. Dabei konnte gezeigt werden, dass stabil exprimierte EGFP-Rac-Isoformen die Proliferationsgeschwindigkeit der H23-Zellen steigerten, was mit einer erhöhten Aktivität der Proteinkinasen p38, JNK2 und Akt korrelierte. Durch die Analyse des Differenzierungsstatus, der Migrationsfähigkeit und der Genregulation wurden Rac1b-spezifische Funktionen in den stabil EGFP-Rac-exprimierenden H23-Klonen identifiziert, die sich von den Rac1-induzierten Effekten unterschieden: Während EGFP-Rac1 einen Cadherin Switch von E-Cadherin zu N-Cadherin und somit eine EMT in den H23-Zellen induziert, wurde der Differenzierungsstatus der stabil EGFP-Rac1b-exprimierenden Zellen, verglichen mit den Kontrollzellen, nicht verändert. Dies geht mit einer unveränderten Migrationsgeschwindigkeit der stabil EGFP-Rac1b-exprimierenden H23-Zellen einher, die in stabil EGFP-Rac1-exprimierenden H23-Zellen reduziert vorlag. Außerdem wurde in Genreporter-Assays gezeigt, dass transient exprimiertes HA-Rac1b(G12V), im Gegensatz zu HA-Rac1(G12V), keine Promotoraktivierung verschiedener Gene bewirken kann. Nur die stabile Expression von EGFP-Rac1b bewirkte in H23-Zellen eine Aktivierung des SRE.L-Reporterkonstrukts, was auf eine Adaptation durch die langfristige Rac1b-Expression zurückgeführt werden könnte. In dieser Arbeit konnte für Rac1b keine tumor-fördernde Funktion in der NSCLC-Zelllinie H23 identifiziert werden. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit verschiedene 3D-Kultivierungsmethoden miteinander verglichen, die weitere Einflüsse auf das Zellverhalten berücksichtigen und so die komplexe Situation im Tumor eher nachstellen können als 2D-Kulturen. Darunter fallen das Wachstum als 3-dimensionaler Zellverbund und die Kultivierung in einer Hydrogelmatrix. Dabei wurden die NSCLC-Zelllinien H358 und H23 mit verschiedenen 3D-Kultivierungsmethoden kultiviert. Durch die anschließende Analyse der Zell/Zell- und Zell/Matrix-Kontakte wurde die Interaktion der Tumorzellen untereinander und mit ihrer Mikroumgebung unter diesen Kultivierungsbedingungen charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die magnetische Levitation und die Kultivierung in und auf einer Matrigelmatrix verglichen mit der 2D Kultivierung zu einer epithelialen Differenzierung, veränderten Aktivität der Proteinkinasen ERK1/2, p38 und Akt sowie einer veränderten Genexpression in den Zellen führt. Zusammenfassend stellt die modifizierte 3D on-top -Kultivierung auf einer dünnen Matrigelschicht die geeignetste 3D-Kultivierungsmethode dar, um die in vivo-Situation von NSCLC nachzustellen und besser verstehen zu können. The Rho-GTPase Rac1 and its splice isoform Rac1b are overexpressed in many human non-small cell lung cancer. Due to their high sequence homology, most studies did not differentiate between these two isoforms and Rac1b-specific functions are barely characterized so far. Rac1b consists of an additional exon 3b, resulting in a 19 amino acid insertion and is primarily detectable in its active, GTP-bound form. In this study, the impact of Rac1b on tumor cell proliferation, differentiation status, migration, and gene regulation were analyzed. Therefore, the lung adenocarcinoma cell line H23 was used that transiently or stably expressed EGFP, EGFP-Rac1 or EGFP-Rac1b. It could be shown that stably expressed Rac isoforms both increased the proliferation rate of the H23 cells correlating with an increased activity of the protein kinases p38, JNK2 and Akt. By analyzing the differentiation status, migration and gene regulation in H23 cell clones stably expressing EGFP-Rac isoforms, we identified Rac1b-specific functions that differentiate from effects induced by Rac1: While EGFP-Rac1 can induce a cadherin switch from E-Cadherin to N-Cadherin and thus an EMT in H23 cells, the differentiation status of H23 cells stably expressing EGFP-Rac1b remains comparable to that of control cells. The stable expression of EGFP-Rac1b had no effect on the migration rate of these cell clones, whereas in H23 cells stably expressing EGFP-Rac1 the migration rate is reduced. Furthermore, gene reporter assays showed that the transient expression of HA Rac1b(G12V), in contrast to HA-Rac1(G12V), did not result in any activation of several promoter constructs. On the contrary, stably expressed EGFP-Rac1b induced an activation of the SRE.L reporter construct. Our results do not support a tumor-promoting function of Rac1b in the NSCLC cell line H23.Furthermore, in this study, different 3D cultivation methods were compared which consider the role of additional factors in the cellular behavior in order to mimic the complex situation in a tumor. This includes cellular growth in a 3-dimensional association of cells and cultivation in a hydrogel matrix. Here, the NSCLC cell lines H358 and H23 were used in different 3D cultivation methods. By analyzing cell/cell and cell/matrix contacts, the interaction of the tumor cells with each other and with their microenvironment was characterized. We could show that magnetic levitation and cultivation in and on a Matrigel matrix can lead to epithelial differentiation, altered activity of the protein kinases ERK1/2, p38 and Akt as well as to a modified gene expression compared to 2D cultivation. This suggests that the modified 3D on-top cultivation on a thin Matrigel matrix is one of the most appropriate methods to cultivate cells in 3D to mimic and further comprehend the in vivo situation of non-small cell lung cancer.