Regulation der ROS-Produktion in primär afferenten Neuronen der Ratte unter Hypoxie

Abstract

Sauerstoff ist lebensnotwendig für alle Säugetierzellen und speziell Neurone reagieren besonders empfindlich selbst auf kurze Hypoxiephasen. Um sich vor Hypoxie zu schützen, kann jede Säugetierzelle Sauerstoff messen und mit verschiedenen adaptiven Mechanismen reagieren. Es wird angenommen, dass intrazellulär gebildete reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eine zentrale Rolle innerhalb dieser adaptiven Mechanismen, wie z.B. einer veränderten Genexpression, spielen. Abhängig vom untersuchten Zelltyp und den experimentellen Bedingungen konnte in der Vergangenheit sowohl eine Hypoxie-induzierte Zunahme als auch eine Abnahme der intrazellulären ROS beobachtet werden. Die meisten dieser Untersuchungen fanden an isolierten nicht-neuronalen Zellen statt, wie z.B. an Hepatomzellen (Hep3B oder HepG2) oder Kardiomyozyten. Einige Untersuchungen erfolgten auch an neuronalen Zellen, wie z.B. an PC12-Zellen, einer Zelllinie aus einem Nebennierenmarkstumor der Ratte. Innerhalb dieser Studien konnten große Unterschiede der Regulation der ROS-Produktion in den einzelnen Zelltypen festgestellt werden. So kam es z.B. durch die Verwendung eines Hemmstoffes an Komplex I der mitochondrialen Atmungskette (Rotenon) zu einer sinkenden Produktion von ROS in nicht-neuronalen Zellen, aber zu einer steigenden Produktion in kultivierten neuronalen Zellen. Die Situation in intaktem neuronalen Gewebe ist bis jetzt unbekannt. Deshalb wurden in dieser Arbeit unter Verwendung des Fluoreszenzindikators 2´, 7´-Dichlorofluoreszein-Diazetat und der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) Untersuchungen an neuronalen Vitalschnitten unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen durchgeführt. Die CLSM erlaubt eine genaue Unterscheidung einzelner Zellen. Mittels der CLSM konnte so spezifisch die neuronale ROS-Produktion gemessen werden. Um den nicht durch Synapsen vermittelten Einfluss von Hypoxie auf die neuronale ROS-Produktionzu analysieren und eine mögliche Überlagerung der Messergebnisse durchausgeschüttete Transmitter zu vermeiden, wurden in dieser Arbeit die Spinalganglien der Ratte (DRG) für die Versuche ausgewählt, da in ihnen keine synaptische Umschaltung erfolgt. Die Inkubation der Vitalschnitte mit dem Aktivator der Protein Kinase C (PKC), Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), führte zu einer vermehrten Produktion von ROS in den Neuronen, welche sich in einer höheren Fluoreszenzintensität äußerte. PMA führt über eine Aktivierung der PKC zu einer Phosphorylierung der NADPH-Oxidase, welche für die Produktion von ROS verantwortlich gemacht wird. In primär afferenten Neuronen wird die ROS-Produktion folglich über einen PKC-abhängigen Mechanismus gesteigert. Die Inkubation der Vitalschnitte mit Rotenon, einem Hemmstoff des Komplexes I der mitochondrialen Atmungskette führte ebenfalls zu einem Anstieg der ROS-Produktion in den Neuronen. Die gleiche Reaktion auf Rotenon konnten Höhler et al. (1999) bei neuronalen PC12-Zellen beobachten, während es in den meisten nicht-neuronalen Zellen zu einer Abnahme der ROS-Konzentration unter Einfluss von Rotenon kam. Diese Ergebnisse weisen auf einen signifikanten Unterschied der mitochondrialen ROS-Bildung neuronaler und nicht-neuronaler Zellen hin. Rotenon blockiert den Elektronentransfer der mitochondrialen Atmungskette an Komplex I. In neuronalen Zellen verlassen die Elektronen die Elektronentransportkette noch vor der Rotenonbindungstelle, um in Verbindung mit O2 ROS zu bilden. Höhler et al. (1999) wiesen den Komplex I der mitochondrialen Atmungskette als Bildungsort von ROS in neuronalen PC12-Zellen aus, während Chandel et al. (2000) nachwies, dass ROS in nicht-neuronalen Hep3B-Zellen an Komplex III gebildet werden. Die Regulation der mitochondrialen ROS-Produktion ist zelltypspezifisch. In primär afferenten Neuronen der Ratte werden ROS an Komplex I der Atmungskette gebildet. Unter Hypoxie kam es im Vergleich zu den normoxisch inkubierten Vitalschnitten zu keinem signifikanten Anstieg der ROS-Produktion in den Neuronen. Andere Arbeitsgruppen konnten jedoch zeigen, dass es sowohl in neuronalen, als auch in nichtneuronalen Zelltypen zu einer veränderten ROS-Produktion unter Hypoxie kam. Einige Arbeitsgruppen waren sogar in der Lage, einen Zusammenhang zwischen der Hypoxie-induzierten ROS-Bildung und weiteren Zellreaktionen herzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch, dass Hypoxie in den Neuronen zu keiner veränderten ROS-Produktion führt. Folglich spielen ROS in primär afferenten DRG-Neuronen der Ratte im Signaltransduktionsmechanismus der Antwort auf Hypoxie keine Rolle. Oxygen is essential for all mammalian cells, and neurons in particular are highly susceptible for even short periods of hypoxia. In general, every cell posseses oxygen senses and various adaptive mechanisms that protect against the adverse effects of hypoxia. According to one theory of cellular oxygen sensing, intracellularly produced reactive oxygen species (ROS) play a central role by the initiation of such adaptive mechanisms, for example altered gene expression. Previously, both a hypoxia-induced increase and a hypoxia-induced decrease in cellular ROS-production have been observed, dependent on the cell type under investigation and the experimental conditions. Most of these investigations have been conducted on isolated non-neuronal cells such as hepatoma cells (Hep3B and HepG2) and cardiomyocytes, while some have been performed at neuronal cells such as PC12 cells, a cell line from a rat adrenal medullary tumour. Considerable differences in the regulation of ROS production within these cell types became evident in these studies. One of these differences is marked by the effects of rotenone, an inhibitor of complex I of the mitochondrial respiratory chain. It reduces ROS production non-neuronal cells while enhancing it in cultured neuronal cells. The situation in intact neuronal tissue is still unclear. This issue was addressed in the present study by use of the fluorescent indicator 2',7'-dichlorofluorescein diacetate and confocal laser scanning microscopy (CLSM) at vital slice preparations under normoxic and hypoxic conditions. CLSM allowed a precise distinction of individual cell types. Thus, using CLSM the neuronal ROS production could be specifically measured in these slice preparations. Dorsal root ganglia (DRG) of the rat were chosen as a modelsince there is no synaptic transmission within these ganglia and thus, the influence of synapses on hypoxic neuronal ROS production and mixing of the effects by release of transmitters could be avoided. Incubation of these slice preparations with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), an activator of protein kinase C, resulted in an increased ROS production by neurons. PMA activates the PKC by phosphorylation of the NADPH oxidase which is responsible for ROS production in that neurons. Thus, ROS productions by primary afferent neurons can be triggered via an PKC dependent mechanism. Incubation of the slice preparations with rotenone, an inhibitor of complex I of the mitochondrial respiratory chain, also resulted in an increased neuronal ROS production. A similar reaction to rotenone was observed by Höhler et al. (1999) in neuronal PC12 cells while most non-neuronal cell types investigated by other groups responded to rotenone with a decreased ROS production. Rotenone blocks the electron transfer at complex I. Obviously, in neuronal cells electrons leave the electron transport chain proximal to the rotenone binding site to form ROS in conjunction with O2. Höhler et al. (1999) recognized complex I of the mitochondrial respiratory chain as a production site of ROS in neuronal PC12 cells while Chandel et al. (2000) demonstrated ROS production at complex III in non-neuronal Hep3B cells. Thus, regulation of mitochondrial ROS production is cell type specific. In primary afferent neurons of the rat, ROS are formed at complex I of the respiratory chain. In previous investigations an altered ROS production has been demonstrated both in neuronal and in non-neuronal cell types. In the present study on DRG slice preparations, however, no significant changes in neuronal ROS production under hypoxia were observed compared to normoxia. Technical reasons such as an inadequate detection system or pure viability of the neurons can be largely excluded due to the successful stimulation of the neurons with PMA and rotenone. Consequently, ROS do not play a major role in the signal transduction mechanisms in response to hypoxia in primary afferent DRG neurons of the rat.