Herstellung einer VEGF depletierten RPE Zelllinie zur Etablierung eines VEGF Biosensorsystems für die nicht-invasive Messung im Auge

Abstract

Bei neovaskulären Krankheiten wie der altersassoziierten Makuladegeneration oder der diabetischen Retinopathie kommt es zu einer Überproduktion von VEGF im Bereich der Netzhaut. Durch Gefäßneubildungen oder erhöhte Exsudation kommt es zu Ablösungen der Netzhaut und zu massiven Einschränkungen des Sehvermögens. Die bisherige Therapie besteht unter anderem aus klonalen VEGF-Antikörpern, welche subretinal injiziert werden. Eine Messung der direkten Auswirkung und eine personalisierte Anpassung der Therapie ist dabei nicht möglich. Um einen neuen Biosensor zur VEGF-Messung im Auge nutzen zu können, war das Ziel der Arbeit daher eine Zelllinie zu etablieren, die kein eigenes VEGF produziert.Der Gen-Knockout des VEGF ist mithilfe des CRISPR-Cas9 Systems erfolgt. Dazu wurden mehrere guideRNAs erstellt, welche die Cas9 Endonuklease spezifisch zur richtigen Basensequenz im Genom führen soll. Nach Klonierung der Guides in ein Plasmid, welches für Cas9 codiert, und Kontrolle der Ausführung, zeigten drei Guides eine gute Aktivität im Test mit dem NHEJ-Sensor. Nach Optimierung der Transfektions- und Selektionsbedingungen für die ausgewählten ARPE-19 Zellen wurde die Transfektion mit diesen drei Guides in verschiedenen Kombinationen durchgeführt.Durch die Separation einzelner Zellklone wurden verschiedene Zelllinien etabliert, welche anschließend auf den erfolgreichen Gen-Knockout auf Proteinlevel kontrolliert wurden. Der dafür verwendete Sandwich-ELISA zeigte drei Zelllinien auf, bei denen das VEGF unter der Nachweisgrenze lag. Im Proliferationsassay zeigte sich keine Verminderung der Zellteilung im Vergleich mit den Wildtyp ARPE-19 Zellen.In folgenden Schritten gilt es nun den VEGF-Biosensor auf der Zellmembran dieser Zellen zu verankern und die Zellen im Bereich der Augenhintergrundes immobilisiert dauerhaft zu kultivieren. Dann kann durch die Zugabe des Luciferasesubstrats jederzeit die aktuelle VEGF-Konzentration gemessen werden und die Therapie entsprechend angepasst werden. Neovascular diseases like the age-related macular degeneration or the diabetic retinopathy come along with a pathological upregulation of VEGF in the area of the retina. The formation of new vessels and an increased exudation leads to a detachment of the retina and thereby to a loss of vision. Amongst others, the treatment of these diseases is composed of the subretinal injection of monoclonal antibodies targeting VEGF. A measurement of the direct impact and a personalized adjustment of the therapy is still not possible. The aim of this study was the creation of a cell line unable to express VEGF on its own, thereby allowing the use of a new biosensor detecting VEGF in the eye.The CRISPR-Cas9 system was used to knockout the VEGF gene. Several guideRNAs were designed to guide the endonuclease Cas9 to the target sequence within the genome. They were cloned in a plasmid which also contains the coding sequence for Cas9, checked for the correct integration and tested for their activity using a custom made NHEJ biosensor. Three of these guides showed high activity and were subsequently used for the knockout strategy. The conditions for transfection and selection of the used ARPE-19 cells were optimized whereupon the transfection was carried out using three guideRNAs in different combinations.After the transfection, single cell clones were separated and subsequently tested for the success of the knockout at protein level. The VEGF-sandwich-ELISA detected no VEGF expression in three cell lines. The proliferation assay showed no reduction of the cell division rate compared to wildtype ARPE-19 cells.After finishing this study with the generation of the three VEGF-knockout cell lines, the VEGF-biosensor can be expressed on the surface of these cells. An immobilization of the cells and implantation in the eye opens the possibility of a noninvasive measurement of VEGF by only adding the substrate for the luciferase. Thus, the therapy could be individually adjusted for each patient.