Entwicklung der ff. sp. avenae, tritici und hordei von Blumeria graminis DC. in kompatiblen und inkompatiblen Systemen mit Avena sativa L., Hordeum vulgare L. und Triticum aestivum L.

Abstract

Anhand der Hafer cv. Erbgraf und Barra sowie der Gersten cv. Aura und Weizen cv. Kanzler wurden alle möglichen Kombinationen mit den ff. sp. avenae, hordei und tritici von Blumeria graminis vergleichend untersucht. Neben der makroskopisch erkennbaren Pilzentwicklung auf künstlich inokulierten Blättern ganzer Pflanzen oder Blattsegmenten wurden umfangreiche histologische Analysen durchgeführt. Durch einen Vergleich kompatibler und inkompatibler Wirt-Pathogen-Kombinationen sollte ermittelt werden, in welcher Phase der Pilzentwicklung bzw. der Ausprägung von Abwehrreaktionen der Wirtspflanzen eine deutliche Differenzierung zwischen kompatibel und inkompatibel erkennbar ist. Nach quantitativen, vergleichenden mikroskopischen Analysen sind folgende Aussagen möglich: Unabhängig von Wirtspflanze und ff. sp. des Erregers waren die Befunde derart ähnlich, dass alle Wirt-Pathogen-Kombinationen gemeinsam wie ein System behandelt werden können. Hinsichtlich der Parameter Konidienkeimung auf Blattoberflächen, Sekundäre Keimhyphen und Appressorien, Penetration durch die Epidermis und Papillenbildung gab es bei keiner der Kombinationen signifikante Unterschiede in der Pilzentwicklung: Morphologische Veränderungen nur im Sinne einer Abwehrreaktion waren nicht zu erkennen. Bei der Wanderung der Zellkerne zum Penetrationsort waren die Befunde uneinheitlich. Die Anzahl kollabierter Zellkerne und Epidermiszellen waren in den inkompatiblen Kombinationen meist beträchtlich erhöht. Dagegen war die Anzahl gebildeter und intakter Haustorien signifikant verringert. Diese Befunde entsprechen der deutlich geringeren, makroskopisch erkennbaren Pilzentwicklung auf den Getreideblättern.Nach Vorinokulation mit den inkompatiblen ff. sp. wird in den Blättern aller drei Getreidearten innerhalb 24 Stunden eine signifikante Resistenz gegen die jeweilige kompatible f. sp. induziert. Eine zuvor anfällige Pflanze wird somit in eine resistente Pflanze umgewandelt. Am cv. Erbgraf sollten detaillierte histologische und chemische Analysen Aufschluß geben, ob die Resistenzausprägung bei Inkompatibilität und induzierter Resistenz auf gleichen Grundlagen beruht. Von wenigen Ausnahmen abgesehen entsprechen die beobachteten Veränderungen nach Resistenzinduktion denen bei Inkompatibilität. Nur bei der Anzahl gebildeter und intakter Haustorien war ein deutlicher Unterschied zu erkennen. Bei Inkompatibilität war eine starke Schädigung dieser Phase der Pilzentwicklung zu verzeichnen, während die Verhältnisse bei der induzierten Resistenz denen der kompatiblen Kontrolle entsprachen. Dies deutet auf Unterschiede in den beiden Systemen der Resistenz hin. In Sequenzanalysen wurden 2, 4, 6 und 8 Tage nach Inokulation der Avenalumingehalt der Haferblätter mittels HPLC quantitativ bestimmt. Eine kontinuierliche de novo Synthese dieser antimykotischen Phytoalexine erfolgte selbst in dem kompatiblen System Erbgraf - f. sp. avenae. In den inkompatiblen Systemen war diese Synthese noch deutlich ausgeprägter und nach induzierter Resistenz und nachfolgender Inokulation mit f. sp. avenae am stärksten. Korrelationsanalysen ergaben 7 dpi in allen Fällen klare negative Beziehungen zwischen Avenalumingehalt der Haferblätter und Anzahl der Pustel der inokulierten f. sp. avenae. Bei höherer Dichte des Inokulums betrugen sie r= -0,86-0,98, bei niedriger Dichte r= -0,70-0,71. Diese Beziehungen weisen auf eine Bedeutung der Avenalumine bei der Abwehr von B. graminis an Hafer hin. Die Rolle der Avenalumine als antimykotische Resistenzfaktoren wurde durch weitere Untersuchungen komplementiert. Da Avenalumine mittels PAL synthetisiert werden, wurde versucht, durch Anwendung der PAL-Inhibitoren Aminooxyessigsäure, Cumarsäure, Glyphosate und Zimtsäure, die Entwicklung von B. graminis f. sp. avenae auf Haferblättern zu beeinflussen. Die signifikant höheren Zahlen der Mehltaupusteln/cm² sowohl im kompatiblen System als auch bei Resistenzinduktion beweisen eine starke Verringerung der Widerstandskraft und unterstreichen die Rolle der Avenalumine als Resistenzfaktoren. In einem weiteren Ansatz wurden vor der Inokulation der f. sp. avenae wässrige Lösungen von Avenalumin I und II mit jeweils 200 µg/ml auf Haferblätter aufgesprüht. Dies führte zu einer drastischen Verringerung der Pilzentwicklung und besonders der Haustorienbildung. Die Avenalumine sind sicher nicht die alleinige Basis der Resistenz von Haferblattgeweben gegen B. graminis. Nach den vorliegenden Untersuchungen haben sie jedoch eine bedeutende Funktion bei der Abwehr des Erregers. Neben den Avenaluminen wurde auch das ebenfalls induzierbare Scopoletin auf seine Wirkung gegen B. graminis geprüft. Es erwies sich als ebenso wirkungsvoll wie Avenalumine. Seine mögliche Rolle bei der Abwehr von B. graminis bleibt aber noch aufzuklären. Im Laufe der Untersuchungen wurde eine neue Färbemethode entwickelt, die es ermöglicht, Oberflächen- und subcuticuläres Myzel in unterschiedlichen Färbungen differenziert darzustellen. Diese eignet sich nicht nur für die in dieser Arbeit dargestellten Interaktionen. Sie ist für eine Reihe anderer pilzlicher Kranheitserreger erfolgreich getestet worden und findet mittlerweile auch praktische Anwendung in anderen Forschungsbereichen. All combinations of the ff. sp. from B. graminis with oat cv. Erbgraf and Barra, barley cv. Aura and wheat cv. Kanzler have been observed in detail by comparative investigations. The comparison of compatible and incompatible host-pathogen combinations should enable to answer the question in which phase of fungal development or the manifestation of defence reactions respectively, a clear differentiation between compatible and incompatible is possible. The following statements can be made after quantitative, comparative microscopic analysis: Based on the similarity of all findings and the independence from the host plant and the ff. sp. of the pathogen, all host-pathogen combinations could be regarded as one system. In all combinations there were no significant differences in the development of the fungus in relation to germination of conidia on leaf surfaces, secondary germ tubes and appressoria formation, penetration through the epidermical cell wall and papillae formation. No morphological defence reactions could be observed. Concerning the migration of plant nuclei to the penetration sites different results have been obtained. The number of collapsed nuclei and epidermical cells was generally higher in incompatible interactions. In comparison, the number of haustoria and intact haustoria was significantly lower.These results underline a distinct lower and macroscopic visible fungal development on leafs of cereals. Pre-inoculation with incompatible ff. sp. induced a significant increase of resistance against the related compatible f. sp. within 24 hours. Therefore, a former susceptible plant changes into a resistant one. Detailed chemical and histological analysis should give hints whether the defence in the case of incompatibility and induced resistance have the same basis. Most of the observed alterations after resistance induction were identical with those of incompatible interactions. There were only a few exceptions. Great differences appeared in the number of haustoria formed and intact haustoria. This part of the fungal development severally affected in case of incompatibility whereas after induced resistance there was no difference to the compatible control. The avenalumin-content of oat leafs has been analyzed by HPLC 2, 4, 6 and 8 days after inoculation. A continuous de novo synthesis of these antimycotic phytoalexins appeared also in the compatible system Erbgraf - f. sp. avenae. In incompatible systems this synthesis was higher and reached their highest levels in cases of resistance induction challanged by inoculation with f. sp. avenae. Between the avenalumin-content of oat leafs and the number of pustules of the inoculated f. sp. avenae 7 dpi correlation analysis revealed distinct negative correlation. With increasing density of the inoculum they reached values of r = -0,86-0,98, with lower density r = -0,70-0,71. These results pointed out, that avenalumins play an important role in the defence of oats against B. graminis. Further investigations confirmed the significance of avenalumins as antimycotic factors in resistance. The most important enzyme during the synthesis of avenalumins is Phenylalanine ammonia-lyase (PAL). After application of inhibitors of PAL, such as amino-oxy acetic acid, coumaric acid, glyphosate and cinnamic acid, the development of B. graminis f. sp. avenae on oat leafs was affected. The significantly higher numbers of mildew pustules/cm² after inhibitor application in the compatible system as well as in systems with resistance induction demonstrated a drastic reduction of the resistance level and underlines the importance of avenalumins in the process of resistance. The effects of aqueous solutions of avenalumin I and II with 200 µg/ml each have been tested by spray applications on oat leafs before inoculation with f. sp. avenae. The fungal development, especially the haustoria formation, decreased drastically after this treatment. Avenalumins are most likely not the only factors in resistance in oat leaf tissue against attack of B. graminis. However, according to the present observations they take an important part in the mechanism of defence against plant pathogenic fungi. The phenolic substance Scopoletin can accumulate in cells of resistant plants after fungal infection. It showed likewise effective results as found in experiments with avenalumins. Its possible role in the defence against B. graminis remains to be explored. A new method has been developed to differentiate plant pathogenic fungi on and inside leaf tissues with better contrast. It is very suitable for the observation of hyphae on upper leaf surfaces, especially the penetration sites as well as inside the tissue. A combination of acid fuchsin and lacto cotton blue was used. The mycelium on the upper surface is stained blue, whereas the subcuticular, intra- and intercellular mycelium is stained red. This new method has also been tested successfully for a wide range of fungal species and has meanwhile become part of a standard staining program in numerous scientific laboratories.