Competitive ELISAs confirm that equine arteritis virus-infected horses develop antibodies to the M viral envelope protein

Abstract

Die global ansteigende Zahl von Infektionen mit dem Equinen Arteritis Virus (EAV) lässt darauf schliessen, dass die Equine Virus Arteritis (EVA) zu den 'emerging diseases' gezählt werden kann. Ein schneller, präziser und zuverlässiger serologischer Test ist notwendig zur Einhaltung von Im- und Export-Bestimmungen und damit unerlässlich zur Prävention zukünftiger EVA-Ausbrüche. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, einen verbesserten diagnostischen Test für EVA zu entwickeln, der neue Erkenntnisse bezüglich der humoralen Immunantwort von EAV infizierten Pferden berücksichtigt. Ein unbehandeltes Zelllysat aus mit EAV Klon 030H infizierten BHK-21 Zellen wurde als Antigen für die Entwicklung von direkten ELISAs (d-ELISA) und competitiven ELISAs (c-ELISA) verwendet. Desweiteren wurden monoklonale und polyklonale Antkörper gegen die Strukturproteine GL, N, M und ein Nicht-Strukturprotein, nsp1, von EAV eingesetzt. Die Herstellung eines nsp1-spezifischen monoklonalen Antikörpers (MAb), MAb 12A4, ermöglichte die Entwicklung eines c-ELISAs. Die gegen das GL Protein gerichteten MAbs wurden aufgrund unzureichender Signalgebung für einen Einsatz in einem c-ELISA ausgeschlossen. Letztendlich wurden MAb 12A4, 3E2 (anti-N) und ein monospezifisches Kaninchen anti-M Serum für den Einsatz in den verschiedenen c-ELISA Testmethoden ausgewählt. Eine Auswahl von 50 positiven und 50 negativen Pferdeseren, alle mittels Serumneutralisationtests (SN) vorgetestet, wurde im c-ELISA eingesetzt. Eine Inhibition von positiven Pferdeseren konnte lediglich mit dem gegen das M-Protein gerichteten anti Peptid Serum erzeugt werden. Dabei wurde eine Test-Spezifizität von 100% und eine Sensivität von 86% ermittelt; eine Regressionsanalyse der OD-Werte zeigte eine starke und signifikante Korrelation (r2 = 0.82) zu den Titern der Serumneutralisationstests derselben Seren. Die experimentelle Auswertung der Daten verschiedener c-ELISA Testmethoden deutet darauf hin, dass das M-Protein ein Hauptziel der Immunantwort von EAV infizierten Pferden ist. Dennoch erreichte keine der entwickelten c-ELISA Testmethoden eine mit dem SN-Test vergleichbare Sensitivität. The increasing number of equine arteritis virus (EAV) outbreaks worldwide suggests that equine viral ateritis (EVA) is an emerging disease. A quick, accurate and reliable serological test would be invaluable in preventing future outbreaks of EVA, and for import/export regulation pertaining to EAV infection of horses. The objective of this study was to further characterize the humoral immune response of horses to EAV with a long-term objective of designing an improved diagnostic serologic test. Using a crude cell lysate of BHK-21 cells infected with the EAV clone 030H as antigen, direct and competitive enzyme-linked immunosorbent assays (c-ELISAs) were developed using monoclonal and polyclonal antibodies to structural (GL, N and M) and non-structural (nsp1) viral proteins. An nsp1-specific monoclonal antibody, MAb 12A4, was produced to facilitate development of a c-ELISA using this protein. All MAbs against the GL protein gave insufficient signal for further use in a c-ELISA; MAb 12A4, 3E2 and a monospecific rabbit anti-M serum were selected for use in different c-ELISAs. A panel of 50 positive and 50 negative equine sera, confirmed by serum neutralization (SN), was tested in the c-ELISA. Only the antipeptide serum against the M-protein showed inhibition of positive horse sera, respectively showing a specificity of 100% and a sensitivity of 86%. Regression analysis of OD values in the ELISA confirmed a strong and significant correlation to the SN titers of the same sera (r2= 0.82). Data obtained using the various c-ELISAs confirm that the M protein is a major target of the antibody response of horses to EAV. However, none of the c-ELISAs that were developed were as sensitive in detecting EAV-specific antibodies in horse sera as the existing SN test.