The contents and effects of polyphenols in chocolate : qualitative and quantitative analyses of polyphenols in chocolate and chocolate raw products as well as evaluation of potential implications of chocolate consumption in human health

Abstract

Schokolade und Kakao im allgemeinen und die darin enthaltenen Polyphenole im speziellen haben in letzter Zeit aufgrund vermuteter positiver Gesundheitseffekte insbesondere im Zusammenhang mit Herz-Kreislauferkrankungen, verschiedener Krebserkrankungen sowie weiterer sogenannter degenerativen Erkrankungen wiederholt die wissenschaftliche Aufmerksamkeit erweckt. Allerdings gibt es bisher nur sehr wenig gesicherte Erkenntnisse über die genaue qualitative und quantitative Zusammensetzung von Polyphenolen in Schokolade, über deren Bioverfügbarkeit und Metabolismus sowie über deren tatsächliche Aktivität in vivo. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Anwendung modernster analytischer Untersuchungsmethoden, insbesondere Hochdruckflüssigkeitschromaographie gekoppelt online mit Elektrosprayionisierung-Masenspektrometrie (HPLC-ESI-MS) sowie - nach Isolierung und Aufreinigung einzelner Polyphenolen aus Schokolade mittels Kombination verschiedener chromatographischer Techniken - Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), 26 phenolische Substanzen, u.a. Flavan-3ole (Catechine), oligomere Procyanidine sowohl mit Einfach- (B-Typ) wie mit Doppelbindungen (A-Typ),Quercetin Aglykon und Glykoside, und schließlich Hydroxyzimtsäurederivate, in Schokolade nachgewiesen. Zwei dieser phenolischen Substanzen - Caffeoyltyrosine and p-Coumaroyldihydroxyphenylalanine - wurden dabei zum ersten Mal in Kakao oder Schokolade beschrieben. Durch Entnahme von Proben in verschieden Schokoladeherstellungsverfahren und quantitativer Analyse der Polyphenolgehalte in Kakaobohnen verschiedener Herkunftsländer, Kakaokernen, Kakaomassen und Schokoladen mithilfe der optimierten und validierten HPLC-MS Methode sowie anschließender multivariater Datenanalyse (Hauptkomponentenanalyse) konnte gezeigt werden, dass der Fermentierungsgrad der Kakaobohne, die Temperatur-Zeit Verhältnisse des Röstprozesses sowie die An- bzw. Abwesenheit eines Alkalisierungsschrittes die Hauptdeterminanten für Gehalt und Zusammensetzung von Polyphenolen in Schokolade sind. Desweiteren wurden oligomere Procyanidine als empfindlichste Fraktion identifiziert und oxidative Degradierung, Epimerisierung sowie Deglykosilierung als Mechanismen für die beobachteten Veränderungen in der Polyphenolzusammensetzung postuliert. Im Rahmen einer kleinen Pilot-Bioverfügbarkeitsstudie konnte die Aufnahme von Epicatechin, dem quantitativ vorherrschenden Kakaopolyphenol, und Spuren des Procyanidin Dimers B2 sowohl aus Bitterschokolade als auch aus Milchschokolade gezeigt werden. Die Analyse mittels HPLC-MS von Blut und Urin vor und in kurzen Zeitintervallen nach dem Verzehr ergab die Anwesenheit von acht Epicatechinmetaboliten bei gleichzeitiger virtueller Absenz von freiem Epicatechin, was auf eine schnelle Verstoffwechselung von Epicatechin hindeutete. In dieser Studie gab es keine Hinweise auf die Absorption höherer oligomerer Procyanidine in ihrer intakten Form. Die Beobachtung verschiedener Phenolsäuren im Urin lassen möglicherweise auf Verstoffwechselung nicht-absorbierter Polyphenole durch die Colonmikroflora und anschließender Aufnahme der Spaltprodukte schließen.Schließlich wurde die biologische und analytische Validität zweier vielversprechender Marker für in vivo oxidative DNA Schädigungen (8-Hydroxydeoxyguanosine), verbunden mit der Entstehung von Krebs, bzw. Lipidperoxidation (15-F2t-Isoprostan), verbunden mit der Entwicklung von Herz-Kreislauferkrankungen, diskutiert, sowie die Messunsicherheit und biologische Variabilität der beiden Marker in einer Pilotstudie quantifiziert. Recently, chocolate and cocoa and in particular bioactive polyphenols present in significant amounts in these foods have gained much attention owing to suggested health beneficial effects, such as in the treatment of cardiovascular diseases, cancer, as well as other degenerative diseases. However, sound knowledge on the qualitative and quantitative polyphenol composition in chocolate, their bioavailability and metabolism as well as bioactivity in vivo is still lacking. In this work, twenty-six phenolic compounds, including various flavan-3-ols (catechins), oligomeric procyanidins both with a single (B-type) and a double linkage (A-type), quercetin both in the free form (aglykon) and linked to glycosides, and hydroxycinnamic acid derivates were identified by high-performance liquid chromatography-electrospray-ionisation-mass spectrometry (HPLC-ESI-MS) as well as nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy following isolation and purification of polypenols from chocolate by combination of various chromatographic techniques. Two of the isolated phenolic compounds, caffeoyltyrosine and p-coumaroyl-dihydroxy-phenylalanine were described for the first time in cocoa or chocolate. Samples of fermented cocoa beans from various origins, cocoa nibs, cocoa liquor, and final chocolate mass were taken from different chocolate making process lines and were then analysed by the optimized and validated multi-compound HPLC-ESI-MS method. From multivariate statistical analysis (principal component analysis) of the data it was evident that the degree of fermentation of cocoa beans, the duration and temperature of roasting, and - if applied - alkalising were the key process parameters in the chocolate making process responsible for decline and change in profile of polyphenols from the cocoa bean to the final product chocolate. Moreover, it was possible to identify the oligomeric procyanidins as the most labile compounds and to suggest oxidative degradation, epimerisation and deglycosidation as responsible mechanisms for the observed changes. The results of a little pilot study for the bioavailability of polyphenols from chocolate evidenced uptake of epicatechin, the quantitatively most important chocolate polyphenol, both from milk and dark chocolates as well as traces of procyanidin dimer B2. HPLC-MS analyses of polyphenols and their metabolites in blood and urine revealed the predominant presence of eight epicatechin metabolites while the free epicatechin was virtually absent suggesting quick metabolism of polyphenols. There was no evidence within this study for absorption of any higher oligomeric procyanidin in its intact form from chocolate. Several phenolic acids were observed in the urine samples, which might be an indication for metabolism of un-absorbed cocoa polyphenols by the colonic microflora followed by absorption of breakdown products. Finally the biological and analytical validity of two promising markers of in vivo oxidative DNA damage (8-hydroxydeoxyguanosine), linked to the development of cancer, and lipid peroxidation (15-F2t-isoprostane), related to the development of cardiovascular diseases, respectively, were discussed and the measurement uncertainty as well as the biological variability quantified in a pilot study.