Sekretion von endogenem Digitalis und Corticosteroiden aus bovinen Nebennierenrinden- und Nebennierenmarkzellen

Abstract

Ouabain, ein vor 200 Jahren als afrikanisches Pfeilgift entdecktes herzaktives Steroid, ist ein neues Steroidhormon der Nebenniere. Es ist kaum etwas darüber bekannt, wie Herzglykoside in der Nebenniere synthetisiert werden und wie sie auf die Sekretion anderer Steroidhormone wie z.B. die des Cortisols einwirken. Bei der Untersuchung dieser Fragen wurden folgende Resultate erzielt:

Es wurde ein System zur Kultivierung primärer Nebennierenrindenzellen (NNRZ)des Rindes etabliert. Die Zellen wurden dabei auf ihre Fähigkeit Ouabain und Cortisol zu sezernieren untersucht. Andere Zellen wie primäre Nebennierenmarkzellen des Rindes, Zellen der PC12-Zelllinie und auch Suspensionskulturen der Nebennierenrindenzellen eigneten sich nicht für die geplanten Untersuchungen. Es wurden die basalen und stimulierten bzw. inhibierten Sekretionsraten von Cortisol und Ouabain in den Experimenten verglichen. NNRZ sezerniereninnerhalb von vier Stunden in Kultur 900.000-fach mehr an Cortisol als anOuabain. Die Gehalte beider Steroide wurden in den Zellüberständen undintrazellulär mit einem ELISA gemessen. Die Ouabainsekretion lag im Bereichvon 1 pmol/mg Protein x Std. 1. ACTH (1myM) stimulierte die Ouabainfreisetzung um den Faktor 1,9; Angiotensin II (100nM) und Phenylephrin (10myM) hatten keinen Einfluss auf die Ouabainsekretion. Die Gewebekonzentrationen an Ouabain ließen sich nur nach Frieren/Tauen der Zellen verbunden mit einer Ultraschallbehandlung bestimmen. Wir fanden dabei eine deutliche Erhöhung der intrazellulären Gehalte unter ACTH- und Pregnenolon-Einfluss. Entgegen bisher publizierter Behauptungen fanden wir eindeutig keine stimulierende Wirkung des Angiotensin II auf die Ouabainbiosynthese und -freisetzung und nur eine geringgradige Stimulation des Cortisols. Es wurde vergleichend untersucht, ob aus Progesteron und Pregnenolon Ouabain und Cortisol gebildet werden können. Die beiden Steroidhormone Pregnenolon und Progesteron sind Vorläufer sowohl des Cortisols, dessen Synthese sich durch Metyrapon, einen Hemmstoff der 11beta-Hydroxylase, hemmen ließ als auch des Ouabains. Die Aufnahme und Verwertung für die Biosynthese von Cortisol erfolgte nach einer Sättigungskinetik mit der halbmaximalen Sättigung im Bereich von 14-18 myM Pregnenolon bzw. Progesteron. Die Ouabainsynthese wurde in Gegenwart von Pregnenolon besser als durch Progesteron stimuliert. Corticosteron und Aldosteron sind keine Vorläufer der Ouabainsynthese. Metyrapon hat keine Wirkung auf die Ouabainbiosynthese aus Vorläufer-Steroiden. Die 11-Hydroxygruppe des Ouabains ist somit wie im pflanzlichen Wirkstoff alpha-ständig. Es wurde untersucht, ob Digitoxigenin ein Vorläufer des Ouabains ist. Die Frage konnte durch direkte Stimulation der Ouabainbiosynthese bzw. freisetzung nicht geklärt werden, da die Ouabain-Antikörper mit Digitoxigenin kreuzreagierten. Es fand sich jedoch bei der vergleichenden Untersuchung der Cortisolspiegel eine 50-fache Stimulierung der Cortisolfreisetzung durch Digitoxigenin (1myM). Ouabain und Digoxin hemmten dagegen die ACTH-stimulierte Cortisolausschüttung in nanomolaren Konzentrationen. Es wird vermutet, dass NNRZ in Gegenwart physiologischer (nanomolarer) Konzentrationen der beiden Herzglykoside unter Kreislauf-Stress-Bedingungen mit der Cortisolfreisetzung interferieren.

Ouabain is a new steroid hormone of the adrenal gland, which was discovered about two centuries ago as an african arrow poison. There is not much known about its biosynthesis in the adrenal gland and how it affects the secretion of other steroidhormones, i.e. cortisol. Our studies resultes in the following:

We established a system for cultivation of bovine primary adrenal cells. These cells are able to release ouabain and cortisol. Adrenal medulla cells, cells of the PC12-cell-line and a human adrenocortical cell-line were inappropriate. We compared the secretion rates of cortisol and ouabain: Primary cultures of adrenocortical cells produced 900.000-times more of cortisol than of ouabain (1 pmol/mg protein x h 1). Both steroidhormones were detected by an competitive immuno assay. ACTH (1myM) increased ouabain release (factor 1.9) whereas angiotensin II (100nM) and phenylephrine (10myM) had no influence. To measure intracellular ouabain cells had to be frozen first and then sonicated. Using this method we found an increase of the intracellular ouabain content after ACTHstimulation, and under exposure to pregnenolone or progesterone. We tested wether ouabain and cortisol use progesteron or pregnenolon asprecursors. Both steroids enhanced cortisol and ouabain biosynthesis in a saturable manner. Half-maximal velocity was found at 14 and 18 myM pregnenolon and progesteron, respectively. This is consistent with the assumption of others. Corticosterone and aldosterone are no precursor of the biosynthesis of ouabain. Metyrapone, an inhibitor of 11beta-hydroxyalase, was an inhibitor of the biosynthesis of cortisol but not of ouabain. Strengthening thus the argument that oubabain in mammals has an alpha 11-hydroxygroup like in plants. Trials to reveal whether digitoxigenin is converted to ouabain were not successful since the compound interacted with the antibody used for the ELISA. Digitoxigenin however stimulated cortisol release 50 times. In contrast ouabain and digoxin inhibited the activation of cortisol-release by ACTH at nanomolar concentrations suggesting that such concentrations may regulate cortisol release invivo under conditions of stress by exercise.