In vitro-Untersuchungen zur Bildung und Metabolisierung konjugierter Östrogene in der Rinderplazenta während der Gravidität und unter der Geburt

Abstract

In der Plazenta des Rindes werden während der Gravidität große Mengen rezeptorinaktiver, sulfokonjugierter Östrogene gebildet, deren biologische Funktionbisher unbekannt ist. Für die Aktivierung und Inaktivierung dieser Östrogene sind zwei Enzyme von Bedeutung: die Steroidsulfatase aktiviert diesulfokonjugierten Östrogene durch Hydrolyse, während die Östrogensulfotransferase die freien Östrogene durch Sulfokon-jugation inaktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Verteilung der Östrogensulfotransferaseaktivität (STA) bzw. Steroidsulfataseaktivität (SA) auf Karunkel- undKotyledonengewebe zu untersuchen, sowie ein Aktivitätsprofil dieser beiden Enzyme in der zweiten Trächtigkeitshälfte und unter der Geburt zu erstellen.Ferner wurden die subzelluläre Lokalisation bestimmt sowie Anhaltspunkte zur Substratspezifität der Östrogensulfotransferase und Steroidsulfatase erhalten.Ergänzend wurde die STA bzw. SA im Myometrium als möglichem Zielorgan untersucht, und die Plazenta mit dem Corpus luteum, als einem anderensteroidogenen Organ, hinsichtlich der Exprimierung dieser beiden Enzyme verglichen. Die Untersuchungen wurden an Homogenaten aus Trophoblast- und Karunkelgewebe von 150 (n=4), 220 (n=4), 240 (n=3) und 270 (n=3) Tage tragendenKühen sowie Geburtstieren (n=4) unter Zugabe von radioaktiv markiertem Estron bzw. Estronsulfat durchgeführt. Weiterhin wurde die Umwandlung vonradioaktiv markiertem Estron bzw. Estronsulfat in Homogenaten aus der Ring- bzw. Längsmuskelschicht entstammendem Myometriumsgewebe (Tag 150: n=3,Tag 240: n=2, Tag 270: n=1) und aus Gesamtmyometrium (Tag 220: n=2, Tag 240 und 270: n=1) sowie aus Corpus luteum Gewebe von graviden (n=8) undingraviden (n=4) Kühen bestimmt. Ferner wurden sub-zelluläre Fraktionen aus Trophoblast- und Karunkelgewebe von 150 (n=4), 220 (n=4), 240 (n=3) und270 (n=3) Tage tragenden Kühen mit radioaktiv markiertem Estron bzw. Estronsulfat inkubiert, und die Substratspezifität der Enzyme mit äquimolaren Mengenan radioaktiv markiertem Estron, Estradiol-17[beta], Estradiol-17[alpha], Dehydroepiandrosteron oder Testosteron bzw Estronsulfat oderDehydroepiandrosteronsulfat getestet. Die Sulfokonjugation von Estron erfolgte sowohl im Trophoblast- als auch im Karunkelgewebe der untersuchten Tiere unabhängig vom Trächtigkeitsstadium.Im Trophoblastgewebe wurde signifikant (p < 0,001) mehr Estron sulfokonjugiert als im Ka-runkelgewebe. Unter der Geburt kommt es zu einem Abfall derSTA im Kotyledonengewebe. Übereinstimmend fand die Sulfokonjugation sowohl im fetalen als auch im maternalen Anteil der Plazenta fast ausschließlich imCytosol statt. Es wurden Estron, Estradiol-17[beta] und Estradiol-17[alpha] jedoch weder Dehydroepiandrosteron noch Testosteron sulfokonjugiert. Die Hydrolyse von Estronsulfat war zu den untersuchten Trächtigkeitszeitpunkten konstant. Unter der Geburt kam es sowohl im Kotyledonen- als auch imKarunkelgewebe zu einem signifikanten Abfall der SA. Im Karunkelgewebe wurde signifikant (p < 0,001) mehr Estronsulfat hydrolysiert als imTrophoblastgewebe. Die Hydrolyse fand sowohl im fetalen als auch im maternalen Anteil der Plazenta vor allem in der Mitochondrien-, Mikrosomen- undKernfraktion statt, im Cytosol wurde kaum eine Hydrolyse von Estronsulfat beobchtet. Es wurden sowohl Estronsulfat als auch Dehydroepiandrosteronsulfathydrolysiert, wobei die Hydrolyse von Dehydroepiandrosteronsulfat durch einen bis zu 10000fachen Überschuß von Estronsulfat nicht gehemmt wurde. In beiden untersuchten Schichten des Myometriums konnte zum Teil eine deutliche Sulfokonjugation von Estron und in geringerem Maße auch eine Hydrolysevon Estronsulfat beobachtet werden. In Corporae luteae cyclicae und graviditates wurde eine deutliche Hydrolyse von Estronsulfat aber kaum eineSulfokonjugation von Estron gemessen. Die Untersuchungen zeigen, daß die Sulfokonjugation von Östrogenen vor allem im Trophoblastgewebe erfolgt, während die Hydrolyse von Estronsulfatvorwiegend im Karunkelgewebe stattfindet. Die plazentaren Östrogene verlassen die Kotyledone bereits in sulfokonjugieter Form, könnten daher entwedereinen autokrinen Faktor oder eine inaktive Transportform darstellen. Es wurde kein Anstieg sondern ein Abfall der SA unter der Geburt beobachtet, dieunmittelbar ante partum vermehrt auftretenden freien Östrogene im peripheren Plasma des Rindes scheinen daher aus einer Überlastung derÖstrogensulfotransferase zu resultieren. Die hohe SA im Karunkelgewebe deutet darauf hin, daß es sich hierbei um ein mögliches Zielorgan der konjugiertenÖstrogene handeln könnte. Die Östrogensulfotransferase weist eine hohe Substratspezifität für Östrogene auf. Die Ergebnisse der Untersuchungen hinsichtlichder Substratspezifität der plazentaren Steroidsulfatase des Rindes lassen keinen eindeutigen Schluß zu, es wird neben Estronsulfat auchDehydroepiandrosteronsulfat in der Plazenta des Rindes hydrolysiert, es ist aber unsicher ob von dem selben oder unterschiedlichen Enzymen. The biological function of large amounts of receptor inactive sulfoconjugated estrogens produced during pregnancy in cattle is largely unknown. Activation andinactivation of estrogens is controlled by two enzymes, steroidsulfatase (S) and estrogensulfotransferase (ST). The present work investigates the activity of bothenzymes in caruncular and cotyledonary tissue and establishes an activity profile during the second half of pregnancy and parturition. Furthermore thesubcellular distribution of steroidsulfatase activity (SA) and estrogensulfotransferase activity (STA) was investigated as well as their substrat specifity. Inaddition STA and SA were determined in the myometrium as a likely target organ of the sulfatase pathway and in the steroidogenic organ 'corpus luteum'. The investigation was performed with homogenates from trophoblast- and caruncular tissue of cows being pregnant 150 (n=4), 220 (n=4), 240 (n=3) and 270(n=3) days re-spectively and parturient animals (n=4) using radio-labelled estrone and estrone sulfate as substrate. Substrate conversion was estimated incircular and longitudinal myometrial muscles of pregnant cows (day 150, n=3; day 240, n=2; day 270, n=1 of pregnancy) in total myometrium (day 220, n=2;day 240, n=1; day 270, n=1 of pregnancy) and in corpora lutea of pregnant (n=8) and non-pregnant (n=4) cows. Similarly subcellular frac-tions fromtrophoblast and caruncular tissue of 150 (n=4), 220 (n=4), 240 (n=3) and 270 (n=3) pregnant cows were incubated with radio-labelled estrone andestronesulfate. To test for substrate specifity of ST and S respectively, equimolar concentrations of radio-labelled estrone, estradiol-17[beta],estradiol-17[alpha], dehydroepiandrosterone, testosterone and estrone sulfate and dehydroepiandrosterone sulfate, were used as substrates. Sulfoconjugation of estrone was observed in trophoblastic and caruncular tissue without showing any relation to the state of gestation. There was a significanthigher (p<0.001) sulfoconjugation in the trophoblast compared to caruncular tissue. At parturition a decrease of STA was observed. In both, the fetal andmaternal part of the placentome, sulfoconjugation occured only in the cytosolic fraction. Estrone, estradiol-17[beta] and estradiol-17[alpha] weresulfoconjugated, while dehydroepiandrosterone and testosterone were not. Hydrolysis of estrone sulfate was independent of the stage of pregnancy. However,SA decreased at parturition in caruncular and cotyledonary tissue. SA was higher (p<0.001) in caruncular tissue than in the trophoblast. In respect tosubcellular fractions SA in both the maternal and fetal compartment was mainly associated with the microsomal, mitochondrial and nuclear fraction, there washardly any enzyme activity detected within the cytosolic fraction. Both estrone sulfate and dehydroepiandrosterone sulfate were hydrolyzed and hydrolysis ofdehydroepiandrosterone sulfate was not affected by a 10000 fold access of estrone sulfate. In all myometrium layers a distinct sulfoconjugation of estrone could be demonstrated, as well as a weak hydrolysis of estrone sulfate. In the corporae luteaegraviditates and cyclicae a distinct hydrolysis of estrone sulfate but no sulfoconjugation of estrone were observed. The results clearly demonstrate that sulfoconjugation of estrogens primarily occurs in the trophoblast while hydrolysis of estrone sulfate is primarily observed incarunsular tissue. Placental estrogens are released from the cotyledonary tissue (trophoblast) in conjugated form and might either be considered as an autocrineregulatory factor or an ineffective transport form. The observed increase of free estrogens in peripheral plasma prior to parturition is probably due to the lack ofSTA and not due to an increased hydrolysis, because of the lower SA found at parturition. The high SA in caruncular tissue indicates that caruncular cells are alikely target organ for initially conjugated estrogens. STA shows a higher substrate specifity for estrogens while the results obtained for the specifity of bovineplacental SA do not allow final conclusion.