Untersuchungen zur Wirkung von neurotrophen Wachstumsfaktoren auf die Proteintyrosinphosphorylierung und die depolarisationsinduzierte Glutamatfreisetzung in Synaptosomen der Ratte

Abstract

Die neurotrophen Wachstumsfaktoren NGF, BDNF, NT-3 und NT-4 sowie PDGF, steuern über spezifische Rezeptoren ihre Wirkung an Nervenzellen. Neben Wachstum von Neuronen und deren Differenzierung kommt es durch diese Faktoren aber auch zu weiteren Zellantworten. Eine für die neuronale Aktivität besonders wichtige Antwort ist die Neurotransmitterfreisetzung, da so die neuronale Signaltransduktion gesteuert wird. Als Zellsystem eignen sich zum Studium von Vorgängen der Neurotransmitterfreisetzung Synaptosomen, in denen der nötige Exozytoseapparat vorhanden ist. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass nach vorheriger Inkubation von aus Rattenhirn gewonnenen Synaptosomen mit den Neurotrophinen NGF, BDNF, NT-3 und NT-4 eine Zunahme der depolarisationsinduzierten Glutamatfreisetzung erreicht werden kann. Diese ist, wie für BDNF nachgewiesen werden konnte, zeit- und konzentrationsabhängig. Für die Wachstumsfaktoren PDGF-AB und PDGF-BB konnte ein solcher Effekt nicht gezeigt werden. Über welche intrazelluläre Signalkaskade die Wachstumsfaktoren ihre Zellanwort vermitteln, ist noch immer nicht vollständig geklärt. In den Synaptosomen der Ratte befindet sich nur ein inkompletter Proteinbiosyntheseapparat, so dass sie sich für die Studien der Langzeitantwort auf neurotrophe Wachstumsfaktoren nicht eignen. Die Untersuchungen zeigen auf, dass die intrazelluläre Antwort auf Stimulation von Rattensynaptosomen mit den Neurotrophinen NGF, BDNF, NT-3 und NT-4, sowie mit den Wachstumsfaktoren PDGF-AB und PDGF-BB über Phosphorylierung von Proteinen an ihren Tyrosinresten vermittelt wird. Dies, so konnte nachgewiesen werden, ist abhängig von der Dauer sowie von der Konzentration der Stimulation der Zellsysteme mit dem Wachstumsfaktor BDNF. Ein während dieser Zellantwort an Tyrosinresten phosphoryliertes Protein ist ein Synaptosomenprotein mit der apparenten Molmasse von 38 kDa. In Immuno-(Western)-Blots sowie mit Hilfe von Immunfällungen konnte gezeigt werden, dass es sich bei diesem Protein um Synaptophysin handelt. Die intrazelluläre Tyrosinphosphorylierung durch Stimulation von Synaptosomen mit BDNF unterscheidet sich deutlich von dem nach Depolarisation der Synaptosomen erhaltenen Proteintyrosin-phosphorylierungsmuster. Neurothrophic growth factors like NGF, BDNF, NT-3, NT-4 and PDGF exert their effects by acting on specific receptors on neurons. Neuronal growth and differentiation are evocated by these growth factors. Furthermore, neurotransmitter release is triggered by these growth factors, thereby regulating neuronal signal transduction. Synaptomsomes contain the necessary exocytose system, thus being appropriate to study the mechanisms of neurotransmitter release. In the present work, it has been shown that incubation of rat cerebral synaptosomes with NGF, BDNF, NT-3 and NT4, respectively, increases the depolarization-induced glutamat release. In the case of BDNF, this effect depends on time and concentration of incubation. Moreover. The analysis of PDGF-AB and -BB revealed no change of depolarization-induced glutamat release. The intracellular signal cascade triggered by growth factors is still not fully understood. Rat cerecral synaptosomes do not contain the complete system necessary for protein biosysnthesis, thus being inappropriate for the studies on long-term responses on neurotrophic growth factors. The present investigation shows that the intracellular response on stimulation with NGF, BDNF, NT-3, NT-4, PDGF-AB and PDGf-BB, respectively, is triggered by tyrosinphophorylation of proteins. In the case of BDNF, this effect is time- and concentration-dependent. During this cellular response a synaptosomal protein with an apparent molar mass of 38 kDa gets phosphorylated at its tyrosin rests. Further experiments demonstrated that this protein is synaptophysin. Intracellular tyrosinphophorylation by BDNF-triggered synaptosomal stimulation is markedly different from the proteintyrosinphosphorylation pattern evocated by depolarization of synaptomsomes.