Signaling pathways of heme oxygenase-1 gene activation by lipopolysaccharide and NAD(P)H oxidase inhibitor 4-(2-aminoethyl) benzensulfonyl fluorid in monocytes

Abstract

Heme oxygenase-1 (HO-1) is the inducible isoform of the first and rate-limiting enzyme of heme degradation and is up-regulated by a host of stress stimuli. Activation of the HO-1 gene not only protects cells and tissues against oxidative damage, but also modulates the inflammatory immune response. Lipopolysaccharide (LPS) is a prototypical mediator of inflammation and is known to activate the phagocyte NAD(P)H oxidase. To further understand the regulatory role of HO-1 in mononuclear phagocytes during inflammation, the HO-1 gene regulation by LPS and by the NAD(P)H oxidase inhibitor 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride (AEBSF) was investigated in the monocytic cell line RAW264.7. HO-1 gene expression was markedly induced by LPS and, unexpectedly, also by AEBSF in these cells. To determine the molecular mechanisms and signaling pathways of HO-1 gene expression by these compounds, reporter gene constructs with proximal HO-1 promoter gene sequences were examined in transiently transfected RAW264.7 cells. Up-regulation of HO-1 promoter activity by LPS was decreased by pharmacological NF-kappaB inhibitors and by overexpression of dominant negative mutants of NF-kappaB inducing kinase, inhibitor of NF-kappaB (IkappaB) kinase beta and IkappaB alpha. The p38 MAPK inhibitor SB203580 and overexpressed dominant negative p38 beta decreased, whereas p38 delta increased, LPS-dependent induction of HO-1 gene expression. Deletion and mutation analysis with transfected HO-1 promoter gene constructs indicated that a CRE/AP-1 site (-668/-654), but not an E-box motif (-47/-42), was involved in LPS-dependent HO-1 gene regulation. AEBSF-dependent induction of endogenous HO-1 gene expression and promoter activity was abolished by treatment with chemical inhibitors of the phosphatidyl inositol 3-kinase/ protein kinase B (PKB) pathway and overexpression of dominant negative mutants of PKB. Accordingly, cotransfected constitutive active PKB markedly up-regulated HO-1 promoter activity. Inhibition of p38 alpha and p38 beta prevented the induction of HO-1 gene expression by AEBSF. p38 was stimulated by AEBSF in a PKB-dependent manner as demonstrated by a luciferase assay with a Gal4-CHOP fusion protein. Deletion and mutation analysis indicated that both, the E-box and the CRE/AP-1 element, were essential for mediating the full response of HO-1 promoter activity to AEBSF. Cotransfection of the coactivator p300 and the basic helix-loop-helix transcription factor USF2 enhanced the AEBSF-dependent response of the HO-1 promoter activity. Taken together, the data indicate that the NF-kappaB, PKB and p38 signaling pathways play an important regulatory role for the induction of HO-1 gene expression by LPS and the NAD(P)H oxidase inhibitor AEBSF in mononuclear phagocytes. Häm Oxygenase (HO)-1 ist die induzierbare Isoform des Schrittmacherenzyms des Hämabbaus und wird durch verschiedene Stressstimuli heraufreguliert. Die Induktion des HO-1 Gens schützt nicht nur Zellen und Gewebe vor oxidativem Stress, sondern ist auch an der Regulation der entzündlichen Immunantwort beteiligt. Lipopolysaccharid (LPS) ist ein prototypischer Auslöser von Entzündungen und aktiviert die monozytäre NAD(P)H Oxidase. Um die Rolle der HO-1 in mononukleären Phagozyten während Entzündungsreaktionen aufzuklären, wurde die Regulation des HO-1 Gens durch LPS und den NAD(P)H oxidase Inhibitor 4-(2-Aminoethyl) Benzensulfonyl Fluorid (AEBSF) in der Monozytenzelllinie RAW264.7 untersucht. In diesen Zellen wurde die Expression des HO-1 Gens nicht nur durch LPS, sondern überraschenderweise auch durch AEBSF induziert. Um die molekularen Mechanismen und die Signalwege der HO-1 Genexpression durch diese Substanzen zu bestimmen, wurden Reportergenkonstrukte mit der proximalen Promotorregion des Ratten HO-1 Gens in transient transfizierten RAW264.7 Zellen verwendet. Die LPS-abhängige Induktion der HO-1 Promotoraktivität wurde durch pharmakologische NF-kappaB Inhibitoren und durch Überexpression dominant negativer Mutanten der NF-kappaB inducing kinase , des Inhibitors von NF-kappaB kinase sowie von IkappaB alpha herunterreguliert. Der p38 MAPK Inhibitor SB203580 und die Überexpression einer dominant negativen Mutante von p38 beta führten zu einer Herabsetzung der LPS-abhängigen Induktion der HO-1 Genexpression. Durch Transfektionsstudien mit HO-1 gezielt mutierten Promotergenkonstrukten konnte gezeigt werden, dass ein CRE/AP-1 Element (-668/-654), jedoch nicht ein E-Box Motiv (-47/-42), an der durch LPS vermittelten HO-1 Genregulation beteiligt war. Die AEBSF-abhängige Induktion der endogenen HO-1 Genexpression und der HO-1 Promotoraktivität wurden durch Behandlung mit chemischen Inhibitoren des Phosphatidyl-inositol 3-Kinase/ Protein Kinase B (PKB) Signalwegs und durch Überexpression einer dominant negativen Mutante von PKB gehemmt. Kotransfektion einer konstitutiv aktiven Mutante der PKB führte zu einer deutlichen Heraufregulation der HO-1 Promotoraktivität. Durch spezifische Hemmung der p38 alpha und p38 beta MAPK Isoformen wurde die Induktion der HO-1 Genexpression durch AEBSF verhindert. Mittels eines Reportergenansatzes mit einem Gal4-CHOP Fusionsprotein konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der p38 MAPK durch AEBSF downstream von PKB lokalisiert war. Anhand von Mutationanalyse wurde gezeigt, dass sowohl das CRE/AP-1 Element als auch das E-box Motiv an der Induktion der HO-1 Genexpression durch AEBSF beteiligt waren. Kotransfektionsexperimente mit dem Helix-Loop-Helix Transkriptionfaktor USF2 und dem Koaktivator p300 führten zu einer gesteigerten AEBSF-abhängigen HO-1 Promotoraktivität. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die NF-kappaB-, PKB- und p38- Signalwege eine wichtige Rolle für die Induktion der HO-1 Genexpression durch LPS und den NAD(P)H oxidase Inhibitor AEBSF in Monozyten spielen.