Identifizierung einer Proteinkinase mit Calmodulin-ähnlicher Domäne bei Eimeria bovis und Studien zu ihrer Lokalisation im Parasiten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird bei Eimeria bovis, einem wichtigen Kokzid des Rindes, unter Verwendung von cDNA-Banken aus Merozoiten & #921; eine ungewöhnliche Serin/Threonin-Proteinkinase mit Calmodulin-ähnlicher Domäne (EbCDPK & #921;) identifiziert. CDPKs wurden bisher bei Pflanzen und einigen Protozoen einschließlich Apicomplexa gefunden, nicht aber bei metazoären Tieren. Die cDNA von EbCDPK 1 wurde sequenziert. Nach der Sequenzanalyse ließen sich im kodierten Protein mehrere funktionelle Domänen ermitteln, und zwar: eine katalytische Serin/Threonin-Kinasedomäne, eine Zwischensequenz und eine Calmodulin-homologe Domäne mit 4 Calciumbindungsstellen (EF-Hände). EbCDPK 1 ist damit Calmodulin-unabhängig und wird direkt durch die Bindung von Ca2+ aktiviert. Das Vorhandensein konservierter Aminosäuren in den Subdomänen und aktiven Zentren des Proteins läßt annehmen, daß die Kinase in vivo aktiv ist. Eine potenzielle Myristoylierungsstelle und ein Cluster aus vier basischen Aminosäuren am NH2-terminalen Ende lassen vermuten, daß EbCDPK 1 in einer Membran durch die Acylierung mit einem Myristinsäure-Rest verankert ist. EbCDPK 1 weist eine hohe Homologie zu bestimmten CDPKs aus Apicomplexa auf, welche sich einer von insgesamt drei phylogenetischen Gruppen zuordnen lassen. Drei überlappende Fragmente von EbCDPK 1 wurden in E. coli exprimiert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Fragment 1 deckt die gesamte katalytische Domäne und einen Teil der Zwischendomäne, Fragment 2 einen COOH-terminalen Teil der katalytischen Kinasedomäne und die Calmodulin-homologe Sequenz, Fragment 3 die Calmodulin-homologe Sequenz ab. Nur die Antikörper gegen Fragmente 2 und 3 reagierten im Immunoblot mit EbCDPK 1 in Extrakten aus Sporozoiten, Merozoiten und infizierten Zellen (15 Tage p.i.) im Bereich von 57 kDa. Der Antikörper gegen Fragment 3 wurde zur Lokalisation des Antigens mittels konfokaler Laser-Rastermikroskopie (CLSM) in fixierten Parasiten benutzt. EbCDPK 1 ließ sich bei Methanol-fixierten Sporozoiten und Merozoiten & #921; vorwiegend im apikalen Bereich, mit gewisser Wahrscheinlichkeit in den Mikronemen, nachweisen. Bei Paraformaldehyd/Glutaraldehyd-fixierten Sporozoiten und Merozoiten & #921; kam es offensichtlich zur Antikörperbindung auf der Parasitenoberfläche, insbesondere im apikalen Bereich. Die mögliche Funktion von EbCDPK 1 wird im Zusammenhang mit der Lokalisation des Moleküls im Parasiten diskutiert. An uncommon serin/threonin protein kinase with a calmodulin like domain EbCDPK 1 was identified in the important cattle coccid Eimeria bovis using 1st generation merozoite cDNA expression librarries. Corresponding enzymes have been observed so far in plants and protozoa including Apicomplexa but not in metazoan animales. The cDNA of EbCDPK 1 was sequenced. Sequence analysis suggests three main functional domains of the encoded protein a catalytic serin/threonine kinase domain, a junction domain and a calmodulin like domain with 4 calcium binding sites (EF-hands). The presence of conserved amino acids in the subdomains and active sites suggests in vivo activity of the enzyme. An NH2-terminal potential myristoylation site and clusters of basic amino acids argue for membrane anchoring of the kinase via myristyl residues. EbCDPK 1 shows high homology to a particular group of CDPKs in other Apicomplexa. In addition two groups of genetically different CDPKs are known in this parasite phylum. Three overlapping fragments of EbCDPK 1 were expressed in E. coli and used to immunize rabbits. Fragment 1 contained the kinase domain and a partial sequence of the junction domain, fragment 2 part of kinase domain, the junction domain and the calmodulin like domain, EbCDPK-Fragmen 3 the whole calmodulin like domain. Only antibodies against fragment 2 and fragment 3 reacted with EbCDPK 1 by immunobloting in extracts of sporozoites, first generation merozoites and infected host cells (15 days p.i.) and detected a 57 kDa protein. Antibodies to fragment 3 were used to localize the antigen in the fixed parasites by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The antigen could be shown prodominantely within the apical area of methanol fixed sporozoites and merozoites Ι, probably within the micronemes. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixed parasites bound the antibody predominantly to their surface, particulary in the apical part. Considering the localization of EbCDPK 1 the possible function of the enzyme is discussed