Reinigung und in vitro Charakterisierung des eukaryotischen Chaperonins TRiC aus S. cerevisiae

Abstract

Zahlreiche neu-synthetisierte Proteine benötigen für ihre korrekte Faltung die Beteiligung spezieller Helferproteine, die als molekulare Chaperone bezeichnet werden und sowohl ko- als auch posttranslational wirken. Mitglieder der Hsp70 Klasse binden und stabilisieren an die wachsende Polypeptidkette während der Translation und verhindern dadurch Fehlfaltungen und Aggregation. Darüberhinaus benötigen viele Proteine für ihre vollständige Faltung weitere Faltungshelfer wie z.B. die Chaperonine. Hierbei handelt es sich um große, zylindrische Komplexe, in deren Innern die Faltung von Substraten abgeschirmt von äußeren Einflüssen erfolgt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das Chaperonin TRiC des eukaryotischen Zytosols. Dieser hetero-oligomere Komplex setzt sich aus zwei übereinander gelagerten Ringen zusammen, die jeweils eine Faltungshöhle umschließen und aus 8 verschiedenen Untereinheiten gebildet werden. Ursprünglich wurde angenommen, dass es sich bei TRiC um ein hoch spezialisiertes Chaperonin handelt, das ausschließlich für die Faltung der Zytoskelettproteine Aktin und Tubuline benötigt wird. Mittlerweile konnte aber eine Beteiligung von TRiC auch an der Faltung anderer Substrate nachgewiesen werden, so beispielsweise einer Reihe von Proteinen mit WD-repeat Propeller-Motiven. Für die effiziente Faltung von Substraten benötigt TRiC das Zusammenspiel mit anderen Chaperonen. Während bei der Faltung von Aktin und Tubulinen TRiC eng mit dem Ko-Chaperon GimC/Prefoldin kooperiert, ist das Hsp70 Chaperon Ssb1/2p an der TRiC-vermittelten Faltung von Substraten mit WD-repeats beteiligt. Bislang war unverstanden, auf welche Art und Weise diese Chaperone miteinander interagieren und wie Substrate erkannt werden. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls zur Reinigung von TRiC im Großmaßstab aus S. cerevisiae sowie die Verwendung des gereinigten Komplexes für funktionelle in vitro Studien, anhand derer die TRiC-vermittelte Faltung verschiedener Substrate näher untersucht wurde. Da TRiC in Hefezellen nur in geringen Mengen vorhanden ist, wurden anfangs unterschiedliche Strategien zur Reinigung ausreichender Mengen funktioneller Chaperonin-Komplexe verfolgt. Hierbei erwies sich die Epitop-Markierung einer Untereinheit mit einem Histidin-tag bei gleichzeitiger Überproduktion aller Untereinheiten als erfolgreich. Die Epitop-Markierung interferierte weder mit der Komplexassemblierung noch beeinflusste sie die Funktionalität des Chaperonins. Durch Verwendung einer Ni2+-Affinititätsmatrix sowie drei weiterer chromatographischer Reinigungsschritte wurde der funktionelle Komplex zu einem hohen Reinheitsgrad aus Hefelysat isoliert. Für funktionelle Studien wurde der gereinigte Komplex in einem isolierten System untersucht. Hierzu wurden mittels eines prokaryotischen in vitro Transkriptions / Translationssystems TRiC-Substrate (Aktin, Tubuline) in vitro synthetisiert und deren de novo Faltung in An- oder Abwesenheit von gereinigtem TRiC und weiterer gereinigter, eukaryotischer Chaperone (GimC, bzw. Ssb1p) analysiert. Zusätzlich wurde die Faltung bislang kaum charakterisierter Substrate, die zur Strukturklasse der WD-repeat Proteine gehören, näher untersucht. Die Faltung in vitro synthetisierter Substrate wurde über Zunahme der Löslichkeit verfolgt, da fehlgefaltete Proteine zur Aggregation neigen. Zusätzlich wurden Substrat-spezifische Faltungstests entwickelt, die auf der Interaktion des neu-synthetisierten Polypeptids mit einem Partnerprotein basieren und direkt Aufschluss über den Faltungszustand geben. Mit Hilfe dieser in vitro Faltungstests konnte der Einfluss der individuellen Chaperone auf den Faltungsprozess der verschiedenen Substrate direkt analysiert werden. Hierdurch konnten frühere in vivo Beobachtungen bestätigt werden demzufolge akzessorische Chaperone wie GimC oder das Hsp70 Chaperon Ssb1/2p vornehmlich die Aggregation neu-synthetisierter Proteine verhindern, während der eigentlich Faltungsprozess durch TRiC vermittelt wird. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass mit den in dieser Arbeit entwickelten in vitro Faltungstests eine geeignete Methode zur Verfügung steht, mit deren Hilfe sich zukünftig neue potentielle TRiC Substrate identifizieren lassen. Protein folding in vivo involves the Hsp70 class of chaperones and their associated proteins. In addition, many proteins require the subsequent interaction with the chaperonin family for the completion of folding. Chaperonins are large cylindrical complexes that contain a central cavity with which they bind unfolded polypeptides to promote folding in an ATP-dependent manner. There are two classes of chaperonin complexes: the GroEL-like proteins in eubacteria, mitochondria and chloroplasts, and the TRiC-like family in eukaryotic cytosol and archea. This thesis is focused on the yeast chaperonin TRiC (TCP-1 ring complex), a large 950 kDa multisubunit complex. The complex forms a barrel-like structure consisting of two stacked rings of 8 subunits encompassing the central cavity were folding takes place. In contrast to its orthologues GroEL from E. coli and the archaeal Thermosome from Thermoplasma acidophilum the crystal structure of TRiC is not solved. Although sequence comparison suggests a similar arrangement of its subunits, TRiC appears to be more complex. TRiC is encoded by 8 different genes, whereas the Thermosome consists of only up to 3 different subunits and GroEL is a homo-oligomeric complex. Originally, TRiC was thought to be highly specialized and only required for folding of the highly abundant cytoskeleton proteins actin and tubulins. However, meanwhile also other substrates have been identified among them several proteins belonging to the WD40 repeat family. So far it is not clearly understood how many proteins require TRiC for achieving their proper folding and how recognition of the different substrates occurs. The main focus of this work was the large-scale purification of TRiC from Saccharomyces cerevisiae for functional characterization of this chaperonin by in vitro folding assays with the newly identified substrates. Since TRiC is less abundant in the yeast cytosol, it was necessary to develop a strategy to purify large quantities of the complex. After testing different approaches for expression and purification, success was obtained by simultaneously overexpressing all 8 subunits in yeast. The purification is primarily based on a His-tag fused to one subunit, which still allows the complete assembly of the chaperonin and does not interfere with substrate binding. The function of the purified complex was tested in an isolated system on the folding of newly synthesized polypeptides like actin and the new class of TRiC substrates belonging to the WD40 repeat proteins. The de novo protein folding was monitored by using a prokaryotic in vitro transcription/translation system, in which TRiC and other eukaryotic chaperonins are absent. The efficiency of TRiC-mediated folding was measured in combination with two other eukaryotic chaperones, GimC and Ssb1/2p, known to cooperate with TRiC in a substrate-dependent manner by adding the purified components to the in vitro folding system. The folding-dependency of each substrate was analyzed by different means. In particular, an appropriate assay was specifically developed for each substrate that allowed to monitor the folding state. By performing these in vitro assays, the contribution of each individual chaperone to the folding process of the different substrates could be directly determined. In conclusion, the results approved earlier assumptions derived basically from in vivo data that accessory chaperones (GimC, Ssb1/2p) rather play a role in preventing the newly synthesized polypeptide from aggregating, whereas TRiC promotes actively the folding process. In addition, the in vitro assay developed in this study can be used as a suitable tool for substrate validation of new potential TRiC substrates in future research.