Isolierung, Sequenzierung und Wirkungsprüfung von bioaktiven Peptid-Antibiotika aus Schimmelpilzen

Abstract

Ziel und Gegenstand der Untersuchungen Ziel dieser Arbeit war es, zum einen Peptaibiotika, welche die nichtproteinogene Aminosäure alpha-Aminoisobuttersäure (Aib) enthalten und biologische Aktivität aufweisen, mittels Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) zu sequenzieren. Die zum Teil bereits als Rohmaterial vorliegenden Peptaibiotika sollten in ihrer Struktur aufgeklärt werden, bekannte Sequenzen bestätigt und neue Analoga bestimmt werden. Weiterhin sollten Schimmelpilze in Submerskultur angezogen werden und die von ihnen gebildeten Peptaibiotika durch chromatographische Verfahren isoliert und anschließend sequenziert werden. Weiterhin sollte eine schnelle und aussagekräftige Screeningmethode zur Bestimmung der Peptaibiotika-Produktion von Schimmelpilzen entwickelt und durchgeführt werden. Hierbei stand die schnelle Bestimmung von Teilsequenzen unter Verwendung von geringen Mengen an Probenmaterial im Vordergrund.In abschließend durchgeführten biologischen Aktivitätstests sollten antibiotische Wirkungen der Isolate geprüft werden. Untersuchungsmethoden Die Isolation, Detektion und Analyse neuer Peptaibiotika wurde unter Verwendung der Dünnschichtchromatographie (DC), der (semipräparativen) Hochauflösenden Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) sowie der Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS), welche eine Analyse der Aminosäurezusammensetzung sowie der Aminosäure-Chiralität der Peptaibiotika ermöglicht, durchgeführt. Zur Bestimmung der Primärstruktur der Peptaibiotika wurde die Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) bzw. multiple MS (ESI-MSn) im positiven und negativen Ionisierungsmodus eingesetzt, womit charakteristische Massenfragmente erhalten wurden. Ergebnisse der Untersuchung Unter Anwendung dieser Isolations-, Analysen- und Strukturaufklärungsmethoden konnten neue Sequenzen der Peptaibole Alamethicin F30, Suzukacillin A und Trichobrachin bestimmt sowie bereits bekannte Sequenzen bestätigt werden. Aus dem mikroheterogenen Peptaibol-Gemisch Alamethicin F30, isoliert aus Trichoderma viride NRRL 3199, wurden die Sequenzen von acht neuen Komponenten und den beiden in der Literatur bekannten Hauptkomponenten, aufgeklärt bzw. abgesichert. Für Suzukacillin A, isoliert aus Trichoderma viride, strain 63 C-I, konnten mittels HPLC-ESI-MS mehr als 90% der 20er Peptide neu aufgeklärt und differenziert werden und die 15 Sequenzen dem HPLC Elutionsprofil zugeordnet werden. Zur Analyse der Trichobrachine (TB) wurde der Schimmelpilz Trichoderma parceramosum CBS 936.69 in Submers-Kultur angezogen, die gebildeten Peptaibiotika aufgereinigt und die TB-Gruppen I-III mittels semipräparativer DC isoliert. Für TB I wurden Sequenzen von 10 acetylierten Peptiden mit je 19 Aminosäuren ohne Aminoalkohol bestimmt. In der TB-Gruppe II bestanden die Peptide aus 18 Aminosäuren ohne Aminoalkohol bzw. aus 19 Aminosäuren und dem C-terminalen Aminoalkohol L-Pheol. In TB III wurden Sequenzen von insgesamt 34 11er-Peptiden mit C-terminalen Aminoalkohol bestimmt. Die zur Untersuchung der Peptaibiotika-Produktion verschiedener Schimmelpilze entwickelte schnelle und aussagekräftige Screeningmethode wurde im Begriff Peptaibiomics zusammengefasst. Dies umfasst sowohl die Aufreinigung des von einer vollbewachsenen Nähragarplatte gewonnenen Mycelextraktes mittels Festphasenextraktion, als auch die Verwendung von HPLC-UV und HPLC-ESI-MS. Hiermit konnten Peptaibiotika aus Pilzen der Gattung Trichoderma und Hypocrea erfasst und Teilsequenzen ermittelt werden, mit denen anhand eines Vergleiches mit bereits bekannten Strukturen in einer Peptaibol-Database Aussagen über bekannte oder neue Peptaibiotika-Produzenten getroffen werden konnten. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit Tests auf mikrobiologische Aktivitäten der sequenzierten Peptaibiotika gegen Bacillus subtilis unter Verwendung von Mikrotiterplatten etabliert. Diese Untersuchungen der biologischen Aktivitäten wiesen den Einfluss von Struktur und Konzentration der Peptaibiotika auf die antibiotische Wirkung nach.

The aim of this work was the sequencing of a particular group of microheterogeneous linear peptides. Owing to the presence of α-aminoisobutyric acid (Aib) residues and biological activity, these peptides belong to the family of peptaibol antibiotics or peptaibiotics. A mixture of the microheterogeneous peptaibiotic trichobrachin (TB) was isolated from the culture broth of the filamentous fungi Trichoderma parceramosum CBS 936.69 and peptide mixtures named TB I, TB II and TB III were obtained by preparative TLC. The sequence determination was carried out using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled to electrospray ionization mass-spectrometry (ESI-MS) and MSn (multiple MS) of characteristic fragments in the positive- and negative-ionization mode. The determination of the chirality of constituents was carried out using gas chromatography-mass-spectrometry (GC-MS). The data established the sequences of 10 acylated nonadecapeptides for TB I. TB II contains 10 peptides with 18 or 19 amino acids and an amino alcohol. For TB III 34 sequences each containing 11 residues were determined. The peptaibols alamethicin F30 and suzukacillin A were reinvestigated using the chromatographic methods described above. Ten sequences of alamethicin F30, isolated from Trichoderma viride strain NRRL 3199, were determined. For suzukacillin A, produced by Trichoderma viride, strain 63 C-I individual sequences of 15 acylated eicosapeptides with C-terminal alcohols were elucidated and correlated with the HPLC elution profiles. Further, for the specific and rapid screening of fungi for the production of peptaibiotics a method was developed that enables the detection and sequential characterization of this group of fungal peptides. The method is applicable directly onto filamentous fungi grown on single agar plates and comprises solid phase extraction of the mycelia by organic solvents followed by on-line reversed phase HPLC coupled to ESI-MS. Mass spectral data were acquired using an ion trap mass spectrometer run in the positive ion mode. This analytical methodology is named peptaibiomics and the entirety of peptaibiotics produces by fungi is the peptaibiome. Peptaibiomics have been applied to many species and strains of Trichoderma and teleomorphs Hypocrea.