Funktionelle Charakterisierung der CTCF-vermittelten und hormonsensitiven Enhancer-Blockade

Abstract

Das ubiquitär exprimierte 11-Zinkfingerprotein CTCF spielt eine Rolle in einer Vielzahl von regulatorischen Vorgängen. Von großer Bedeutung ist, dass CTCF in höheren Eukaryonten der einzige Faktor ist, der die Enhancer-Blockade vermitteln kann. Dies ist ein Mechanismus, der Gene vor Enhancer-Einflüssen abschirmt, die von benachbarten Genen stammen. Es wurde bereits gezeigt, dass Thyroidhormon die Enhancer-Blockade auf CTCF-Bindestellen regulieren kann, die sich neben einem Thyroid hormone response element (TRE) befinden. In der vorliegenden Arbeit wurden episomale Vektoren für eine detaillierte Charakterisierung der hormonsensitiven Enhancer-Blockade auf zusammengesetzten CTCF/TR-Bindestellen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass die Intensität der Enhancer-Blockade durch Überexprimierung oder Herunterregulierung von CTCF variiert werden kann. Weiterhin zeigte sich, dass in die CTCF-vermittelte Enhancer-Blockade die Rekrutierung von Histondeacetylasen involviert ist und teilweise von der posttranslationalen Modifikation der poly(ADP)Ribosylierung abhängt. Erstaunlicherweise führten Mutationsanalysen sowohl der CTCF- als auch der TR-Bindestelle zur Erkenntnis, dass beide funktionellen Bindestellen benötigt werden, um die Enhancer-Blockade zu vermitteln. ChIP-Analysen der episomalen Vektoren zeigten, dass die Aufhebung der Enhancer-Blockade durch einen Anstieg an aktivem und Verminderung an inaktivem Chromatin begleitet ist. Die Verwendung eines RNA Polymerase II-Antikörpers in Chromatin-Immunopräzipitationen führte zur Entwicklung eines Modells, welches beschreibt, dass der Isolator und Isolator-bindende Proteine (d.h. CTCF) sich physisch am Promotor befinden und dort die Enhancer-Wirkung auf die RNA Polymerase II verhindern. Die Anwesenheit von Hormon hingegen löst diese Blockade auf, da der Isolator wieder vom Promotor dissoziiert und der Enhancer auf den Promotor wirken kann. Um zu untersuchen, ob Hormon zu einer Konformationsänderung des CTCF/TR-Komplexes als Ursache der Aufhebung des Isolator-Promotor-Komplexes beitragen kann, wurden die Interaktionsdomänen innerhalb von CTCF und TR näher charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von Ligand die Interaktion zwischen CTCF und TR bzw. RXR modulieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass CTCF und TR in der Enhancer-Blockade synergieren und dass die Enhancer-Blockade mit einer physischen Interaktion von Promotor- und Isolator-bindenden Faktoren einhergeht. Alle Ergebnisse zusammen demonstrieren das enge Wechselspiel von CTCF und dem TR bei der Regulation der Genexpression und geben Hinweise auf einen Mechanismus, welcher der funktionellen Isolierung von Chromatin-Domänen in Vertebraten zugrunde liegen könnte