Molecular analyses on the mechanism of nonhost resistance of barley (Hordeum vulgare L.) to the wheat powdery mildew fungus (Blumeria graminis f.sp. tritici)

Abstract

Every plant pathogen has only a limited range of host species on which it can cause disease. The remaining plants are nonhost plants to this pathogen and can resist the attacker due to a multitude of different mechanisms that collectively contribute to nonhost resistance. Due to its durable effectiveness, nonhost resistance has moved into the focus of scientific interest, since it promises to be of use for the generation of resistant crop plants. Considerable effort has been made to elucidate signal transduction processes of plant defense. In spite of a number of investigations, which examined the transcriptome of plants during the interaction with pathogens, particularly powdery mildew fungi, we are still far from understanding the nature of nonhost resistance especially in terms of its constancy. Hence, this study aimed at the advanced understanding of the mechanisms that underlie nonhost resistance and its counterpart, basic compatibility. For this purpose, the model system of barley (Hordeum vulare L.) interacting with appropriate or inappropriate formae speciales of the biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis was used. Since colonization-success of the powdery mildew fungus depends upon the living host cell, it was also part of this work to investigate the role of a putative cell death inhibitor in cell death and defense regulation in barley. A macroarray based approach was followed to comparatively analyze the expression of 1,536 barley gene transcripts in the early host interaction with Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) and the nonhost pathogen Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt), respectively. The cDNA fragments on the macroarray mainly derived from epidermal peels of plants pre-treated with the chemical resistance activating compound acibenzolar-S-methyl, and were therefore expected to be enriched with defense-related transcripts. 102 spots corresponding to 94 genes repeatedly gave B. graminis-responsive signals on the macroarray at 12 and/or 24 hours after inoculation. In independent expression analyses, the differential expression of 18 arbitrarily selected genes could be confirmed. The temporal expression profile of the majority of the genes was similar in the compatible and the incompatible interaction. The data support the view that common genetic and mechanistic elements of plant defense underlie background resistance in compatible interactions and nonhost resistance. BAX INHIBITOR-1 (BI-1) proteins are negative regulators of programmed cell death in mammals and plants. When overexpressed in epidermal cells of barley, BI-1 suppressed non-specific background resistance and mlo-mediated penetration resistance to the biotrophic fungal pathogen Bgh. It could be demonstrated that overexpression of BI-1 partially protected barley cells from cell death and breaks nonhost resistance of barley epidermal cells to the nonhost pathogen Bgt. The degree of transgene-induced accessibility was thereby similar to the effect achieved by overexpression of the defense suppressor gene MLO and could not be further enhanced by simultaneous expression of both BI-1 and MLO. Furthermore, results indicate that during defense suppression, BI-1 modulates defense-associated hydrogen peroxide accumulation underneath the site of attempted fungal penetration. In barley epidermal cells, a functional green fluorescing GFP-BI-1 fusion protein accumulated in endomembranes and the nuclear envelope and was found in the vicinity of the site of fungal attack and/or around intracellular fungal structures. Together, enhanced expression of barley BI-1 suppresses nonhost resistance to Bgt, linking barley nonhost penetration resistance with cell death regulation. Jedes Pflanzenpathogen hat nur ein limitiertes Spektrum an Wirtspflanzen, auf dem es eine Krankheit verursachen kann. Alle anderen Pflanzen sind so genannte Nichtwirtpflanzen für dieses Pathogen, d.h. sie können einer Attacke mit Hilfe unterschiedlicher Abwehrmechanismen widerstehen, die gemeinsam zur Nichtwirtresistenz beitragen. Aufgrund ihrer dauerhaften Wirksamkeit ist die Nichtwirtresistenz in den Fokus wissenschaftlicher Untersuchungen gerückt, weil die Ausnutzung der zugrunde liegenden Mechanismen möglicherweise für die Erzeugung resistenter Kulturpflanzen von Nutzen sein könnte. Die Aufklärung von Signaltransduktionsprozessen der pflanzlichen Abwehr ist seit langem Gegenstand intensiver Forschung. Trotz einer Vielzahl von Untersuchungen, die sich mit dem Transkriptom von Pflanzen während der Interaktion mit Phytopathogenen, insbesondere Mehltaupilzen, befasst haben, ist ein vollständiges Verständnis der Natur der Nichtwirtresistenz vor allem mit Blick auf ihre Konstanz noch in weiter Ferne. Die vorliegende Arbeit sollte zur Aufklärung der zellulären Prozesse und Mechanismen beitragen, die die Nichtwirtresistenz bestimmen. Für diesen Zweck wurde die Interaktion von Gerste (Hordeum vulgare L.) mit passenden und unpassenden formae speciales des Getreidemehltaupilzes (Blumeria graminis) untersucht. Das Pathosystem gilt als Modellsystem für die Interaktion einer Pflanze mit einem biotrophen Pathogen. Da der Erfolg des Mehltaupilzes an die lebende Wirtszelle gebunden ist, wurde außerdem die Rolle eines potenziellen Zelltodinhibitors in Zelltod- und Abwehrregulation in der Gerste überprüft. Für eine vergleichende Expressionsanalyse von 1.536 Genen in der frühen Wirtinteraktion der Gerste mit dem Echten Gerstenmehltaupilz (Blumeria graminis f.sp. hordei, Bgh) und der Nichtwirtinteraktion mit dem Echten Weizenmehltaupilz (Blumeria graminis f.sp. tritici, Bgt) wurde ein auf der Makroarraytechnik basierender Versuchsansatz verfolgt. Die auf die Arraymembranen aufgebrachten cDNA Fragmente stammten hauptsächlich aus Epidermisgewebe von Pflanzen, die mit dem Resistenzinduktor Acibenzolar-S-methyl vorbehandelt worden waren und daher mit abwehrrelevanten Gentranskripten angereichert sein sollten. 102 cDNA Fragmente von 94 Genen zeigten zu den Zeitpunkten 12 und/oder 24 Stunden nach Inokulation Responsivität auf Infektion mit B. graminis. In unhabhängigen Expressionsstudien konnte die differentielle Expression von 18 zufällig ausgewählten Genen bestätigt werden. Die Mehrheit der Gene zeigte sowohl in der kompatiblen als auch in der inkompatiblen Interaktion ein ähnliches Expressionsmuster. Die Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass sowohl die Hintergrundresistenz in der kompatiblen Interaktion als auch die Nichtwirtresistenz von ähnlichen genetischen Elementen bestimmt werden. BAX INHIBITOR-1 (BI-1) Proteine sind als negative Regulatoren des Programmierten Zelltods in Tieren und Pflanzen bekannt. Die Überexpression des BI-1 Gens in Gerste beeinträchtigte sowohl die unspezifische Hintergrundresistenz als auch die mlo-vermittelte Penetrationsresistenz gegenüber Bgh. Neben der zellschützenden Wirkung von Gersten BI-1 konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch die Überexpression des BI-1 Gens sogar die Nichtwirtresistenz von Gerstenepidermiszellen gegenüber Bgt gebrochen werden kann. Durch Einschleusen des Transgens wurde dabei ein ähnliches Suszeptibilitätsniveau erreicht, wie durch die Überexpression des Abwehrsuppressorgens MLO, wobei die gleichzeitige Überexpression der beiden Gene keinen weiteren Resistenz-supprimierenden Einfluss hatte. Weitere Ergebnisse zeigten, dass BI-1 im Zuge der Abwehrsuppression die lokale Akkumulation von Wasserstoffperoxid am Ort der pilzlichen Attacke zu beeinflussen scheint. In Epidermiszellen von Gerste akkumulierte ein funktionelles grün fluoreszierendes GFP-BI-1 Fusionsprotein in Endomembranen und in der Hülle des Zellkerns. Es war ebenfalls am Ort der pilzlichen Attacke und/oder an intrazellulären pilzlichen Strukturen zu finden. Die erhöhte Expression des Zelltodsuppressorgens BI-1 beeinträchtigte somit auch die Nichtwirtresistenz von Gerste gegenüber Bgt und verknüpft damit die Regulation von Nichtwirtinteraktion und Programmiertem Zelltod.