Massenspektrometrische Identifizierung posttranslational modifizierter Proteine aus verschiedenen Entwicklungsstadien von Caenorhabditis elegans

Abstract

Infektionen mit parasitären Nematoden stellen weltweit eine der häufigsten Erkrankungen bei Menschen und Tieren dar. Gleichzeitig stehen nur wenige Therapeutika zur Verfügung. Infektionen mit Nematoden sind meist durch eine lang anhaltende Persistenz gekennzeichnet. Sowohl bei der Invasion als auch bei der Persistenz spielen posttranslationale Modifikationen der Proteine des Parasiten eine zentrale Rolle. Der frei lebende Bodennematode Caenorhabditis elegans stellt für die Untersuchungen der Nematoden ein ausgezeichnetes Modellsystem dar.In dieser Arbeit wurden zwei posttranslationale Modifikationen bearbeitet: die Substitution mit Phosphorylcholin, welches als immunmodulatorische Komponente eine zentrale Rolle im Parasitismus der Nematoden spielt, jedoch auch für die Entwicklung des Nematoden selbst essentiell ist, sowie die Modifikation von Proteinen mit O gebundenem N-Acetylglucosamin. Letztere ist in höheren Eukaryoten bei der Embryonalentwicklung maßgeblich, spielt jedoch auch bei weiteren zentralen zellphysiologischen Vorgängen eine wichtige Rolle. Bislang lagen zur Funktion dieser Modifikation bei Nematoden noch keine Untersuchungen vor. Es wurde das komplette PCom und O-GlcNAcom verschiedener Entwicklungsstadien von C. elegans analysiert. Die Proteine wurden via zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und mittels zweidimensionalen Western-Blots detektiert. Die korrespondierenden Spots wurden aus dem Gel ausgeschnitten und tryptisch verdaut. Die resultierenden Peptide wurden via MALDI-TOF-MS und MS/MS-Experimenten identifiziert. Die Modifikationsmuster der PC-substituierten Proteine erwiesen sich als stadienspezifisch. Insgesamt wurden 73 Proteine identifiziert, die PC-substituiert sind. Die meisten PC-modifizierten Proteine wurden im Eistadium und adulten Stadium gefunden, gefolgt vom Dauerlarvenstadium und L4. Die wenigsten modifizierten Proteine wurden in L2 und L3 gefunden. In L1 konnten keine PC-modifizierten Proteine detektiert werden. Die zelluläre Lokalisierung der PC-modifizierten Proteine ergab, dass sie hauptsächlich im Cytosol und in den Mitochondrien vorkommen. Proteine, die im Nukleus lokalisiert sind, wurden vorwiegend im Ei- und Dauerlarvenstadium gefunden. Im Ei- und Dauerlarvenstadium haben die PC-substituierten Proteine vielfältige Funktionen. Die meisten der identifizierten Proteine aus L4 und adulten Nematoden sind in den Stoffwechsel und den Energie-/Redoxmetabolismus involviert. Bei der O-GlcNAcom-Analyse von C. elegans wurden 64 O-GlcNAc-modifizierte Proteine identifiziert, von denen fünf eine Phosphorylierung von Serin zeigten. Die Modifikation wurde in allen Stadien gefunden. Die meisten Proteine waren im adulten Stadium modifiziert, in abnehmender Häufigkeit gefolgt von L1, dem Eistadium, L3, L4 und L2. Am wenigsten O GlcNAc-modifizierte Proteine wurden im Dauerlarvenstadium gefunden. Sie sind ebenfalls hauptsächlich im Cytosol und in den Mitochondrien lokalisiert. Die Analyse der C. elegans-Stadien ergab, dass die meisten Proteine metabolische Funktion haben. Die starke Dynamik der Proteinmodifikation mit O GlcNAc wird durch die Analyse der einzelnen Stadien gezeigt, da die Mehrzahl der Proteine nur in einem Stadium modifiziert ist. Die gewonnenen Erkenntnisse über diese Proteinmodifikationen und ihre jeweilige stadienspezifische Expression sollen die Grundlage für die Entwicklung neuer Bekämpfungsstrategien der Nematodeninfektionen bilden. Nematode infections are amongst the most common human and animal diseases, but there is only a limited number of therapeutics available. Nematodes produce long-lasting infections that are characterised by little or no immunoprotection. Posttranslational modifications of proteins play an important role in invasion and persistence. The free-living nematode Caenorhabditis elegans has proved to be an excellent model system for (parasitic) nematode investigations.In this thesis, posttranslational modifications of proteins in the developmental stages of C. elegans were analysed: the substitution with phosphorylcholine, which has an immunomodulatory function, plays an important role in nematode infections but is, also important for the development of the nematode. We also analysed the substitution of proteins by O-linked N-acetylglucosamine. This modification has been proved to be essential for the embryonic development of higher eukaryotes as well as playing an important role in vital physiological processes of the cell. Despite the fact that C. elegans is the best-studied model organism, there have been no studies on O GlcNAcylation in this organism so far. The complete PCome and O-GlcNAcome of C. elegans developmental stages were analysed using two-dimensional PAGE separation and 2D-Western-blotting. After in gel digestion with trypsin, the resulting peptides were analysed by MALDI-TOF mass spectrometry and MS/MS-analysis. In the PCome study we could identify 73 PC-modified proteins. The pattern of PC modification was found to be stage-specific. PC-substituted proteins were most abundant in the egg-stage and adult nematodes followed by the Dauer larval-stage and L4. Only a small number of PC-modified proteins were found in L3 and L2. In L1 we could not detect any PC-modification. The cellular localisation of the identified proteins revealed a predominantly cytosolic and mitochondrial occurrence of the PC modification. Nuclear proteins were predominantly found in the egg- and Dauer larval-stages. In these stages, the proteins have considerable functional diversity. Most of the identified proteins of the L4 and adult stages are involved in metabolism and energy-/ redox-metabolism. The O-GlcNAcome study revealed 64 modified proteins. Five of them were, additionally, phosphorylated on serine residues. We found O-GlcNAc-modification in all of the C. elegans stages. The most modified proteins were detected in the adult stage; followed by the L1, egg, L3 and L4 stages. Small amounts of the O-GlcNAc-modification were, also, found in the Dauer larval-stage. The cellular localisation of the identified proteins revealed a predominantly cytosolic and mitochondrial occurrence of the O-GlcNAc-modified proteins. The proteins indicated functional diversity, but they were predominantly involved in metabolism. Most of the identified proteins were modified in only one of the life-cycle stages, this revealed the strong dynamic of protein modification.The results presented in this thesis are intended to form part of a foundation for the development of new strategies in combating nematode infections.