Tryptophanabhängige Synthese von indolhaltigen Pigmenten bei verschiedenen humanpathogenen Asco- und Basidiomyceten

Abstract

Der Begriff "Pigment" beschreibt in erster Linie farbige Substanzen. Pigmente sind aber darüber hinaus für wichtige metabolische oder physiologische Prozesse verantwortlich. Im Reich der Pilze gibt es eine Vielzahl von Pigmenten. Zu ihnen zählen die Melanine, die Carotenoide, die Naphthoquinone, die Phenoxazine, die Flavonoide sowie indolhaltige Pigmente. Gewisse Indolderivate wurden von einer Arbeitsgruppe um Prof. Mayser 1998 erstmals bei der Hefe Malassezia furfur beschrieben, bei der diese Indolderivate in einem klinischen Zusammenhang mit der Hautkrankheit Pityriasis versicolor stehen könnten (u.a. Pityriacitrin, Pityriarubine). Ziel dieser Studie war es, zu klären, inwieweit auch andere Spezies, insbesondere phylogenetisch weiter entfernte Arten, Tryptophan zu indolhaltigen Pigmenten umwandeln können. Des Weiteren wurde versucht zu klären, ob die Assimilation dieser Aminosäure immer die gleichen Pigmente hervorruft.Grundlage der Pigmentbildung stellte - aufbauend auf die Untersuchungen von 1998 - ein um Glucose erweiterter Minimalagar dar, dem neben Tween als Lipidquelle lediglich Tryptophan als Stickstoffquelle beigegeben wurde. Insgesamt wurden 57 Isolate untersucht. Das verwendete Pilzgut, welches sich aus vorhandenem Material der Gießener Hautklinik sowie dem Institut für Medizinische Mikrobiologie der Uniklinik Aachen zusammensetzte, wurde auf diesen Minimalagar verimpft und das Wachstum mit einer möglichen Pigmentbildung beobachtet. Von den positiv getesteten Isolaten wurden ca. 200 Nährbodenschalen angezüchtet und nach vierwöchiger Wachstumsphase das Pigment als Rohextrakt gewonnen. Dieses wurde durch chromatographische Techniken aufgereinigt und Reinsubstanzen hergestellt. Die Strukturaufklärung isolierter Substanzen erfolgte am Biochemischen Institut der Technischen Universität München. In dieser Arbeit wurden elf verschiedene Isolate der Gattung Trichosporon getestet (vergleiche Tabelle 1, Seite 21). Von diesen konnten drei Isolate zur Pigmentbildung angeregt werden (Trichosporon asteroides, Trichosporon cutaneum sowie Trichosporon loubieri). Diese drei Pilze konnten durch strukturaufklärende Untersuchungen als Bildner u. a. des indolhaltigen Pigments Pityriacitrin nachgewiesen werden (siehe Punkt 4.2.3, Seite 54). Geotrichum capitatum, der bis in die 80er Jahre ebenfalls zu den Trichosporon-Hefen gezählt wurde, wurde auch positiv auf Pigmentbildung gescreent. Diese Spezies zeigte ebenfalls die Synthese von Pityriacitrin. Des weiteren fanden 43 Isolate aus dem Bereich der Schwärzepilze Verwendung (vergleiche Tabelle 2, Seite 22) . Unter ihnen wurden 22 positiv auf Pigmentbildung getestet. Diese 22 Pilze stammten von fünf verschiedenen Spezies (fünf von Aureobasidium pullulans, dreizehn von Exophiala dermatitidis, zwei von Exophiala phaeomuriformis, eins von Exophiala spinifera sowie eins von Phialocephala). Auch bei diesen Pilzen konnte die Bildung von indolhaltigen Pigmenten (Pityriacitrin, Pityriarubin sowie Malassezia-Indol A) nachgewiesen werden. Bei Exophiala phaeomuriformis und Exophiala dermatitidis konnten neue Substanzen mit bislang ungeklärter Funktion isoliert werden. Nattrassia mangiferae ebenfalls Angehöriger der Schwärzepilze unterscheidet sich in einigen Punkten von den bereits erwähnten melaninbildenden Pilzen. Während die eben genannten Schwärzepilze zu den black yeasts (schwarze Hefen) gezählt werden, zeigt Nattrassia mangiferae keinerlei Hefeform. Die isolierten Substanzen von dieser Spezies zeigten keine Übereinstimmung mit den bereits bekannten Indolderivaten. Es konnten zwei neue Substanzen mit ebenfalls bislang unbekannter Funktion in ihrer Struktur aufgeklärt werden. Alle negativ gescreenten Isolate der Schwärzepilze bildeten Hyphen und Luftmyzel aus.Die erst seit 1989 als pathogen angesehene hyphenbildende Spezies Schizophyllum commune war ebenfalls Bestandteil dieser Untersuchung. Sie zeigte überraschenderweise auch einen schwachen Peak im Bereich der Elutionszeit des Pityriacitrins auf der HPLC, was auf die Bildung dieses Indolderivats hinweist. Der Schimmelpilz Aspergillus terreus, der bereits auf Kimmig-Agar rot-orangene Verfärbungen zeigt, färbt in der gleichen Art und Weise auch den verwendeten Minimalagar. Eine exakte Strukturaufklärung der von ihm gebildeten Substanzen war leider nicht möglich. Herausgefunden konnte aber, dass es sich dabei um von den vorher erwähnten indolhaltigen Pigmenten verschiedene Strukturen handelt. Zusammenfassend wurde in dieser Studie herausgefunden, dass mehrere Gattungen und Spezies humanpathogener Pilze gleichermaßen wie Malassezia furfur Tryptophan zu pigmentierten Indolderivaten umformen können. Vorherrschend sind Hefen zur Pigmentbildung befähigt. Bei ihnen konnten stets Substanzen aus einer Gruppe bestimmter Indolderivate isoliert werden. Pilze in Hyphenform produzieren weniger häufig Pigmente. Diese haben sich in dieser Untersuchung meist von den bei Malassezia furfur gefundenen Stoffen unterschieden. Aus der Vielfalt der gebildeten Pigmente konnten ebenfalls vier neuartige Verbindungen vorgestellt werden, deren Funktion noch ermittelt werden sollte. Diese zeigten zusätzlich interessante chemische Aspekte. Zur Aufklärung der restlichen Bestandteile des Pigments sollten weitere Untersuchungen folgen. The term "pigment" primarily describes colored agents. In addition, pigments are responsible for important metabolic and physiological processes. A variety of pigments exist in the world of fungi. These include melanins, carotenoids, naphthoquinones, phenoxazines, flavonoids and indole-containing pigments. In 1998, the working group of Prof. Mayser first described some particular indole derivatives in the yeast Malassezia furfur, which might be clinically related to the skin disease pityriasis versicolor (e.g., pityriacitrin, pityriarubins). The aim of the study was to clarify whether other species, in particular phylogenetically more distant ones, are able to transform tryptophan into indole-containing pigments. In addition, it was investigated whether assimilation of this amino acid always produces the same pigments. Following the studies in 1998, a glucose-enriched minimal agar was used as a basis for pigment production; apart from Tween as lipid source, only tryptophan was added as nitrogen source. A total of 57 isolates were investigated. The fungal material, which had been obtained from the Giessen Clinic of Dermatology and the Institute for Medical Microbiology at Aachen University, was inoculated onto this minimal agar and observed for growth and possible pigment formation. Positive isolates were cultured in approximately 200 plates, and pigment was extracted after a growing phase of 4 weeks. This was chromatographically purified to obtain pure substances. Structural analysis of the isolated substances was performed at the Munich Technological University. In the present study, eleven different isolates of the genus Trichosporon were tested (compare Table 1, page 21). Of these, three isolates could be stimulated to produce pigment (Trichosporon asteroides, Trichosporon cutaneum and Trichosporon loubieri). By means of structure analytical studies, these three fungi were found to produce the indole-containing pigment pityriacitrin (see section 4.2.3, page 54). Geotrichum capitatum, which had been assigned to the Trichosporon yeasts until the 1980s, was also positively screened for pigment formation. This species too showed synthesis of pityriacitrin. In addition, 43 isolates from black fungi were used (compare Table 2, page 22). Among these, 22 were positively tested for pigment production. These 22 fungi originate from five different species (five from Aureobasidium pullulans, thirteen from Exophiala dermatitidis, two from Exophiala phaeomuriformis, and one each from Exophiala spinifera and Phialocephala). These fungi too were found to produce indole-containing pigments (pityiracitrin, pityriarubin and Malassezia indole A). In the case of Exophiala phaeomuriformis and Exophiala dermatitidis, new substances with hitherto unknown function could be isolated. Nattrassia mangiferae also a member of the black fungus family differs in some respects from the melanin producing fungi mentioned before. While the latter belong to the black yeasts, Nattrassia mangiferae does not show any yeast form. The substances isolated from this species did not correspond to the indol derivatives already known. Two new substances with hitherto unknown function could be structurally analyzed. All negatively screened isolates of black fungus showed formation of hyphae and air mycelium. The hyphae-forming species Schizophyllum commune, which has been considered pathogenic only since 1989, was also investigated in this study. Surprisingly, it also showed a narrow peak within the elution time of pityriacitrin during HPLC, indicating indole formation. The mould Aspergillus terreus, which shows red-orange pigmentation on Kimmig agar, did so in the same manner on the minimal agar used in the present study. Unfortunately it was not possible to exactly analyze the structures of the substances produced. However, they were found to differ from those of the indole-containing pigments mentioned before. In summary, the present study showed that several genera and species of human pathogenic fungi are able to transform tryptophan into pigmented indole derivatives in a manner equal to that of Malassezia furfur. Predominantly yeasts are capable of producing pigment: Substances from a group of particular indole derivatives could always be isolated. Pigment is less frequently generated by fungi that have hyphae. In the present study, they mostly differed from the substances found with Malassezia furfur. From the variety of pigments produced, four new compounds were presented, the function of which remains to be defined. In addition, they showed interesting chemical aspects. Further studies are planned to elucidate the many other components of the pigment.