Pathogenetische Bedeutung des Hämolysins enterohämorrhagischer Escherichia coli am Modell humaner Nabelschnur-Endothelzellen

Abstract

Hämolysine gehören zu den porenbildenden bakteriellen Exotoxinen. Für uropathogene E. coli ist das gut charakterisierte a-Hämolysin bekannt. Enterohämorrhagische E. coli, die das schwere Krankheitsbild des hämolytisch-urämischen Syndroms verursachen, produzieren ebenfalls ein Hämolysin, das in neuerer Zeit insbesondere strukturell und genetisch charakterisiert wurde. Auch wenn seine klinische Bedeutung sich bereits abzeichnet, existierten über seine konkrete Funktion bislang fast keine Kenntnisse. In der vorliegenden Arbeit wurden daher grundlegende biochemische Parameter von humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) als Antwort auf die Einwirkung des EHEC-Hämolysins im direkten Vergleich mit dem a-Hämolysin bestimmt. Dafür wurde zum einen ein rekombinanter boviner EHEC- (bzw. Shiga-like-produzierender) Stamm verwendet, der in einem Vektorplasmid lediglich die EHEC-Hämolysin-Sequenz enthielt (413/89Hly+), zum anderen ein uropathogener Wildtyp-Stamm (UPEC) mit nachgewiesener ausgeprägter a-Hämolysin-Produktion. Als Kontrolle diente ein apathogener E. coli-Stamm mit dem Vektorplasmid sowie bakterienfreies Wachstumsmedium. Wie erwartet bewirkte der UPEC-Wildstamm mit dem a-Hämolysin eine ausgeprägte schnelle Signaltransduktion, gemessen an dem Anstieg der Inositolphosphate, der bis zum 9-fachen des Kontrollwertes reichte mit ähnlichen Werten durch den bakterienfreien Überstand als Zeichen einer ausgeprägten Sekretion. Der rekombinante Stamm mit dem EHEC-Hämolysin (413/89Hly+) zeigte dagegen einen nur langsamen und schwächeren Anstieg der Inositolphosphate (Maximum bei 3h mit dem 2,8-fachen des Kontrollwertes). Dabei fand sich nur eine geringe Wirkung durch den Überstand alleine als Zeichen einer geringen Sekretion; letzteres ist für EHEC bekannt. Wie aus Untersuchungen mit isoliertem a-Hämolysin bekannt, stimulierte der UPEC-Stamm die Produktion von Prostazyklin. Bei dem EHEC-Hämolysin konnte kein Prostazyklin-Anstieg induziert werden, eine aktive Hemmung war nicht signifikant nachweisbar. Auch die PAF-Synthese wurde erwartungsgemäß durch UPEC gefördert. Überraschend ist hier die Beobachtung, dass im längeren Verlauf die PAF-Werte zum Ausgangswert zurückkehren. Der rekombinante EHEC-Stamm zeigte dagegen einen kontinuierlichen Anstieg des PAF. Der durch das a-Hämolysin induzierte Inositolphosphat-Anstieg wurde um 46 % durch einen unspezifischen Tyrosinkinase-Hemmer, Genistein, reduziert; übereinstimmend mit einzelnen neuen Literaturangaben. Schwieriger einzuordnen ist die Tatsache, dass auch die Wirkung des EHEC-Hämolysins erheblich durch Genistein reduziert wurde. Die genaue Lokalisation der Tyrosin-Phosphorylierung ist nämlich bei EHEC im Gegensatz zu EPEC bisher nicht bekannt. Insgesamt zeigt sich das EHEC-Hämolysin als wirkungsvoller Mediator, der im Rahmen der hämorrhagischen Kolitis und des hämolytisch-urämischen Syndroms auf einen Teil der bisher ungeklärten Fragen zur Pathogenese eine Antwort geben kann. Dabei ergänzt es die Endothelzell-schädigende Wirkung des Shiga-like Toxins und übernimmt insbesondere über die Signaltransduktion sei es rezeptorvermittelt oder durch unspezifischen Ca2+- Einstrom mittels Porenbildung - eine entscheidende Steuerungsfunktion, die über die bekannte zytotoxische Wirkung hinausgeht. Von Bedeutung sind damit die der Signaltransduktion nachgeschalteten Vorgänge. Dies betrifft zunächst die AE-Läsion (Adhäsion), für die eine Abhängigkeit von der Signaltransduktion bekannt ist. Der darüber hinaus in den hier durchgeführten Versuchen gezeigte Einfluss auf die PAF- und Prostazyklin-Synthese fügt sich gut in die bekannten Phänomene des hämolytisch-urämischen Syndroms und der hämorrhagischen Kolitis ein: Im Vordergrund steht die Förderung der Plättchenaggregation über PAF, möglicherweise auch die gleichzeitige Hemmung des Gegenspielers Prostazyklin. Hier zeigt sich ein Synergismus zum Shiga-like-Toxin. Hemolysins belong to the pore-forming bacterial exotoxins; a-hemolysin of UPEC is well characterized. Enterohemorrhagic E. coli causing the hemolytic uremic syndrome also produce a hemolysin, which was structurally and genetically characterized more recently. Even though there is increasing evidence for the clinical impact of this hemolysin, its concrete function is yet unclear. Therefore, in this study the reaction of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) to EHEC hemolysin and a-hemolysin were compared by measuring certain biochemical parameters. A recombinant bovine Shiga-like producing strain, which contained the EHEC hemolysin sequence in a plasmid (413/89Hly+), and a uropathogenic a-hemolysin producing strain (UPEC) was used. An apathogenic E. coli strain was used as a control. As expected, UPEC with its a-hemolysin caused a strong and fast signal transduction, measured by the increase of inositolphosphate, with similar values induced by bacteria and bacteria-free supernatant, indicating the secretion of a-hemolysin. In contrast, the recombinant strain with the EHEC-hemolysin (413/89Hly+) showed a slower and weaker increase of inositolphosphate. Only a small effect was induced by bacteria-free supernatant indicating a low secretion of the hemolysin, which is well-known for EHEC. As known from studies with isolated a-hemolysin, UPEC stimulated the production of prostacyclin. EHEC hemolysin did not increase prostacyclin levels in the HUVECs studied. As expected, PAF synthesis was promoted by UPEC. Surprisingly, PAF values returned to the initial value after long-term stimulation with a-hemolysin. In contrast, the recombined EHEC strain induced a continuous increase of PAF. An increase of inositolphosphate induced by a-hemolysin was reduced by genistein, a non-specific tyrosinkinase inhibitor. This finding is in line with newer data from other groups. Interestingly, the effect of the EHEC hemolysin was also reduced substantially by Genistein. This effect is not well understood since the exact localization of tyrosine phosphorylation in EHEC is not yet known. In conclusion, EHEC-hemolysin is an effective mediator controlling signal transduction in the infected cells, an effect that goes beyond the well-known cytotoxic effect. EHEC-hemolysin promotes platelet aggregation by PAF, possibly also the simultaneous inhibition of the opponent prostacyclin, in synergism to shiga like toxin. These findings contribute to the understanding of the mechanisms causing haemolytic uremic syndrome and hemorrhagic colitis.