Interaktion von Staphylokokken mit Thrombozyten in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen : Zell- und molekularbiologische Untersuchungen

Abstract

In der Pathogenese endovaskulärer Infektionen wie z. B. der Endokarditis, spielt die Assoziation von Bakterien und Thrombozyten einewichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Aufklärung des Adhäsions-mechanismus von Staphylococcusaureus an Thrombozyten durchgeführt. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei sowohl auf die Identifizierung der für die Interaktionrelevanten Rezeptoren auf thrombozytärer und bakterieller Seite, als auch auf die Untersuchung von Plasmaproteinen als Brückenmolekülegelegt. Für die durchflußzytometrische Untersuchung der S. aureus - Thrombozyten -Assoziation konnte eine Methode erarbeitet werden, bei derdie Markierung der Zellen es ermöglichte, Thrombozyten- und Bakterienpopulation in einem Durchflußzytometer mit nur einemAnregungslaser getrennt voneinander darstellen zu können und die Assoziate quantitativ zu erfassen. Untersuchungen zur S. aureus-Thrombozyten-Assoziation lieferten Hinweise, daß die Bindung von S. aureus an Thrombozyten in Formeiner spezifischen Rezeptor-Liganden-Bindung verläuft, an der mehrere Rezeptoren bzw. Adhäsine beteiligt sind. Dabei ist derAktivierungszustand der Plättchen und die damit einhergehenden Veränderungen der Plättchen von entscheidender Bedeutung. Assoziationsversuche in plasmafreiem und plasmahaltigem Milieu ergaben, daß die Anwesenheit von Plasmabestandteilen die Bindungvon S. aureus an Thrombozyten deutlich erhöhte. Dabei konnte die Zugabe von Fibrinogen oder des von Willebrand Faktors/Faktor VIII inAbwesenheit anderer Plasmabestandteile die Assoziationsrate signifikant steigern. Mittels Fluorochrom-markierten Fibrinogens konnte eine spezifische Bindung von Fibrinogen an Thrombozyten und Bakterien gezeigtwerden. Inhibierungsversuche mit Peptiden, welche die Bindung von Fibrinogen an Thrombozyten bzw. an S. aureus hemmen, konnten einedeutliche Reduzierung der Assoziationsrate zeigen. Hiermit ließ sich nachweisen, daß Fibrinogen als Brückenmolekül für die Bindung vonS. aureus an Thrombozyten dient, wobei sowohl die Bindung von Fibrinogen über die RGDS-Sequenz, als auch die Bindung vonFibrinogen an Thrombozyten und S. aureus über die Dodekapeptidsequenz von Bedeutung ist. Anhand durchflußzytometrischer Untersuchungen mit Protein A-, 'clumping factor'-, Koagulase-, und MAP-Deletionsmutanten konntenProtein A und der 'clumping factor', nicht jedoch Koagulase und MAP als Adhäsine für die Bindung von Fibrinogen in Suspension auf S.aureus nachgewiesen werden. Blockierungs-experimente mit einem inhibierenden Antikörper gegen Protein A konnten Protein A alsfibrinogenbindendes Adhäsin auf S. aureus bestätigen. Die Reinigung und FITC-Markierung des von Willebrand Faktors (vWF) ermöglichte den Nachweis der spezifischen Bindung diesesProteins an Thrombozyten und Bakterien im Durchflußzytometer. Mit Antikörpern und deren F(ab´)2-Fragmenten, welche die Bindung des von Willebrand Faktors an die Thrombozyten bzw. an S. aureushemmen, konnte keine Inhibierung der Bindung von S. aureus an Thrombozyten erreicht werden. Untersuchungen eines Patienten mit 'vonWillebrand Disease' Typ3 und eines an Hämophilie A erkrankten Patienten gaben jedoch Hinweise auf eine Beteiligung sowohl des vonWillebrand Faktors als auch des Gerinnungsfaktors VIII an der S. aureus-Thrombozyten-Assoziation. Bindungsstudien an Protein A-Deletionsmutanten und Blockierungsexperimente mit einem anti-Protein-A-Antikörper imDurchflußyzytometer konnten Protein A als Adhäsin für die Bindung des von Willebrand Faktors auf S. aureus identifizieren. Mittels durchflußzytometrischer Untersuchungen an Patienten mit Speicherfunktionsstörungen der Granula ('[alpha]-, [delta]-storage pooldisease' und 'Gray-platelet-syndrome') konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß die Proteine der [alpha]-Granula die Bindung von S.aureus an Thrombozyten vermitteln. Beide Patienten zeigten eine deutlich verminderte Assoziationsrate, welche sich auch durchAktivierung der Plättchen nicht erhöhen ließ. Der Zusatz von gereinigtem Thrombospondin-1 (TSP-1) zu den Assoziationsversuchen mit Plättchen dieser Patienten brachte keineSteigerung der Assoziationsrate zwischen S. aureus und Plättchen. Dieses, im kalziumfreien Milieu in die nicht adhäsive Formübergegangene TSP-1, konnte als Brückenmolekül für die Bindung von S. aureus an Thrombozyten nicht nachgewiesen werden. Da dieadhäsive Eigenschaft von TSP-1 von dessen Konformitätszustand abhängt, konnte anhand der Experimente eine Rolle des TSP-1 alsBrückenmolekül jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Inhibierungsversuche mit Sialyl-Lewis-X, welches die Bindung von CD62 (P-Selektin) auf Plättchen an PSGL-1 hemmt, konnten keineVerminderung der Assoziationsrate zeigen. Assoziationsversuche an P-Selektin-knockout-Mäusen zeigten keinen Unterschied in derBindung von S. aureus an CD62-defiziente Plättchen und Kontrollplättchen. Eine Bindung von S. aureus über P-Selektin an Thrombozytenkonnte somit nicht nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Glykoproteine CD36 und GPIIb/IIIa wurde mit Plättchen von Patienten durchgeführt, denen diese Glykoproteinefehlen. In beiden Fällen zeig-ten die defizienten Plättchen eine mit Kontrollplättchen vergleichbare Assoziations-rate. Dies deutet darauf hin,daß CD36 und GPIIb/IIIa für die S. aureus-Thrombozyten-Assoziation nicht, oder nur von geringer Bedeutung sind. Mittels Untersuchungen an Plättchen von Knockout-Mäusen der Fc[gamma]-Kette, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß dieFc[gamma]-Kette an der Bindung von S. aureus an Thrombozyten beteiligt ist. Die Plättchen der Knockout-Mäuse banden signifikantweniger S. aureus als Plättchen der Kontrolltiere. In einem weiteren Teil der Arbeit konnte über den Aktivierungsmarker CD62 die Aktivierung von Thrombozyten durch S. aureusnachgewiesen werden. Die Aktivierbarkeit der Thrombozyten erwies sich als personenspezifisch. Blockierungsexperimente mit einem denFcRIIA-Rezeptor auf Plättchen inhibierenden Antikörper zeigten, daß die Plättchenaktivierung über diesen Rezeptor vermittelt wird. MittelsPCR konnte der Genotyp des FcRIIA-Rezeptors der untersuchten Personen bestimmt werden und gezeigt werden, daß die Aktivierbarkeitder Thrombozyten in Zusammenhang mit dem für diesen Rezeptor bekannten Polymorphismus steht. So wiesen Personen mit durch S.aureus aktivierbaren Thrombozyten hautsächlich den Genotyp FcRIIA-His/His131, Personen mit nicht aktivierbaren Plättchen den GenotypFcRIIA-Arg/Arg131 und Personen, mit nicht eindeutig aktivierbaren Plättchen den Genotyp FcRIIA-Arg/His131 auf. Weiterhin wurde der Genotyp des FcRIIA-Rezeptors von Patienten bestimmt, welche an einer S. aureus-Endokarditis erkrankt waren. ImVergleich zu gesunden Personen, zeigten diese Patienten deutlich vermehrt den Genotyp FcRIIA-Arg/Arg und waren damit mit der Gruppeder Personen vergleichbar, deren Thrombozyten sich nicht durch S. aureus aktivieren ließen. Dies könnte Anlaß zu der Vermutung geben,daß Personen dieses Genotyps eine Prädisposition für S. aureus-induzierte endovaskuläre Erkrankungen besitzen. Untersuchungen über die Aktivierbarkeit der Thromboyzten durch S. aureus an GPIIb/III-defizienten Plättchen konnten eine Beteiligung desGlykoproteins IIb/IIIa ausschließen. Plättchen eines Patienten mit 'von Willebrand Disease' Typ3 ließen sich nach Substitution mitvWF/FaktorVIII aktivieren. Dies legt neben der Rolle des FcRIIa-Rezeptors die Beteiligung des vWF bzw. Faktor VIII nahe. The association of bacteria and platelets plays a pivotal role in the pathogenesis of vascular inflammatory diseases, particularly inendocarditis. The purpose of this study was to clarify the mechanism by which S. aureus adhere to platelets. Of special interest were theidentification of the receptors from both, the thrombocytic and the bacterial side, which are relevant for the interaction, and the examinationof plasma proteins, which may play a role as bridging molecules. Therefore, a method was developed to examine the association between S. aureus and platelets by flow cytometry. Labelling of both cellswith different fluorochromes allowed it to show platelet and S. aureus populations as well as platelet-S. aureus-associates separately,using a flow-cytometer equipped with only one laser. It was possible to determine the associates quantitatively. Investigations of the S. aureus-platelet-association process provided indication that the attachment of S. aureus to platelets takes place inthe form of a specific receptor-ligand binding in which several receptors and/or adhesins are involved. At the same time, the activated stateof the platelets and the simultaneous changes that take place therein are of decisive importance. Thus, non-activated platelets displayed S.aureus-attachment to a markedly lesser degree than cells which were activated with thrombin. Association experiments in plasma-free and plasmatic milieu showed that the presence of plasma components markedly enhanced theattachment of S. aureus to platelets. By adding fibrinogen or von Willebrand factor/factor VIII to the buffer, the rate of association rosesignificantly in the absence of other plasma proteins. Fibrinogen and von Willebrand factor were identified as bridging plasma molecules. Using fluorochrome-labelled fibrinogen it was possible to demonstrate a specific binding of fibrinogen to platelets as well as to bacteria. Inhibiting experiments using peptides, which inhibit the binding of fibrinogen to platelets and/or to S. aureus, showed a definite reduction inthe rate of association. It was shown that fibrinogen serves as a bridging molecule for binding of S. aureus to platelets. In that process,both, the binding of fibrinogen via the RGDS-sequence and the binding of fibrinogen to platelets and S. aureus via thedodecapeptide-sequence, are of importance. Using protein A-, clumping factor-, coagulase- and MAP-deficient mutants, it was proved that protein A and the clumping factor act asadhesins in the binding of fibrinogen in suspension to S. aureus, whereas coagulase and MAP did not. Blocking experiments using anin-hibiting antibody against protein A, confirmed protein A as a fibrinogen-binding adhesin on S. aureus. By purifying and FITC-labelling of von Willebrand factor it was possible to demonstrate the specific binding of this protein to platelets and tobacteria in the flowcytometer. However, it was not possible to achieve an inhibition of the binding of S. aureus to platelets by using antibodies or their F(ab)2-fragments,which inhibit the binding of von Willebrand factor to platelets and/or S. aureus. The investigation of a patient with von Willebrand diseasetype 3 and a patient suffering from severe hemophilia A gave indication of the participation of both, von Willebrand factor and bloodcoagulation factor VIII in the S. aureus-platelet-association. Protein A was identified as von Willebrand factor binding adhesin on S. aureus; this was accomplished by studying the binding behaviourof protein A deletion mutants and by means of blocking experiments in a flow-cytometer using an antiprotein A antibody. Using platelets of patients with [alpha]-[delta]-storage pool disease and Gray-platelet syndrome it was demonstrated that [alpha]-granuleproteins mediate the binding of S. aureus to platelets. The platelets of both patients showed a significantly reduced rate of association incomparison to control platelets. In contrast to controls platelets, activation of the patients platelets did not significantly promote theadhesion of S. aureus. Addition of purified thrombospondin-1 (TSP-1) to platelets of those patients did not increase the rate of association between platelets andS. aureus. The adhesive function of TSP-1 depends strongly of its conformation. Therefore it cannot completely ruled out by theexperiments that TSP-1 acts as a bridging molecule. Inhibition experiments with Sialyl-Lewis-X, which inhibits the binding of theglycoprotein CD62 (P-selectin) on platelets to its ligand PSGL-1, did not result in a decrease in the association rate. Associationexperiments with P-selectin-knockout mice did not show a difference in the adhesion of S. aureus to CD62-deficient platelets and controlplatelets. Thus, P-selectin seems not to play a role in platelet- S. aureus interaction. The investigation of the role of the glycoproteins CD36 and GPIIb/IIIa in platelet- S. aureus-association was carried out with platelets frompatients lacking these glycoproteins. In both cases the deficient platelets showed a rate of association comparable to that of the controlplatelets. This indicates that CD36 and GPIIb/IIIa are of no, or only minor, importance in the S. aureus-platelet association. In contrast it was possible to show that the Fc[gamma]-chain participates in the binding of S. aureus to platelets. This was done byexamining the platelets of Fc[gamma]-chain knockout mice. The platelets of the knockout mice bound significantly less S. aureus than didthose of the control mice. The activation of platelets by S. aureus using the activating marker CD62 was demonstrated in another part of this thesis. The activatingcapacity of the platelets was shown to be person-specific. Blocking experiments with an antibody, that inhibited the FcRIIa-receptor onplatelets, demonstrated that the activation of platelets by S. aureus is mediated by this particular receptor. The genotype of the FcRIIA-receptor from persons examined above, was carried out by PCR. It was shown that the platelets activatingcapa-bility is connected to a polymorphism known in this receptor. Thus, individuals with platelets activatable by S. aureus were mainly ofgenotype FcRIIa-His/His131, persons with non-activatable platelets belonged prevailingly to genotype FcRIIa-Arg/Arg131, whereaspersons with platelets not clearly belonging to those groups were predominantly of genotype FcRIIa-Arg/His131. Patients suffering from endocarditis caused by S. aureus were classified in respect to the genotype of the FcRIIA-receptor. Nearly all ofthese patients possessed geno-type FcRII-Arg/Arg131. They were thus comparable to that group of patients whose platelets could not beactivated by S. aureus. The FcRIIA-Arg/Arg131 is rare in healthy populations. This could lead to the assumption that individuals of thisgenotype might be predisposed to suffer from endovascular diseases induced by S. aureus. Investigations on the platelets` ability to be activated by S. aureus in GPIIb/IIIa-deficient platelets excluded the participation of glycoproteinIIb/IIIa. However, platelets from the patient with von Willebrand disease type 3 could be activated after substitution with von Willebrandfactor/factor VIII. This suggests the participation of von Willebrand factor and/or factor VIII in addition to the role of the FcRIIa-receptor inplatelet activation by S. aureus.