Biliäre Elimination des Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten Valsartan über die kanalikuläre Plasmamembran der Rattenleber

Abstract

Die molekularen Mechanismen der biliären Elimination des Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten Valsartan wurden in vivo und mit Hilfevon kanalikulären Plasmamembranvesikeln, isoliert aus der Leber von normalen Wistar-Ratten und transportdefizienten TR--Ratten,untersucht. Nach intravenöser Injektion von [14C]-Valsartan ( 1 mg / kg ) in eine Mesenterialvene, wurde die radioaktiv markierte Substanz rasch in dieGalle von normalen Wistar-Ratten eliminiert. Drei Stunden nach der Injektion konnten 81 % der Substanz in der Galle festgestellt werden. ImGegensatz dazu wurde [14C]-Valsartan bei TR--Ratten, die einen Defekt des kanalikulären Transportes organischer Anionen aufweisen (Fehlen des Transportsystems Mrp2 / cMoat ), hauptsächlich im Blut angereichert, nur 39 % wurden über die Galle ausgeschieden. In isolierte kanalikuläre Plasmamembranvesikel von normalen Wistar-Ratten wurde [14C]-Valsartan ATP-abhängig aufgenommen. DieserATP-abhängige Anteil des Transportes war in isolierte Plasmamembranvesikel von TR--Ratten um 50 % vermindert. Dies deutet daraufhin, dass Valsartan ein Substrat des kanalikulären multispezifischen organischen Anionen Trans-porters cMoat / Mrp2 ist sowie einesanderen ATP-abhängigen Transporters, welcher auch in TR--Ratten exprimiert wird. Die ATP-abhängige Aufnahme von [14C]-Valsartan in isolierte kanalikuläre Plasmamembranvesikel von normalen Wistar-Ratten stieg biszu einer Sättigung an, wenn bei einer Valsartan-Konzentration von 57 µM die ATP-Konzentration von 0,5 auf 3,0 mM erhöht wurde ( Km (ATP ) = 1,449 mM, vmax ( ATP ) = 62,22 pmol / mg Protein x Minute ). ATP in Gegenwart oder Abwesenheit eines ATP-regenerierendenSystems war von den verschiedenen Nukleotiden, die untersucht wurden, für die Valsartan-Aufnahme am effektivsten. Die nichthydro-lysierbaren Analoga ( AMP, Adenosin, AMP-PCP ) konnten die Aufnahme nicht signifikant steigern. Für transportkinetische Studien wurde Valsartan in einem weiten Konzentrationsbereich eingesetzt ( 10 - 500 µM ). Eine Sättigung wurdebei der ATP-abhängigen ( Km = 65,91 µM, vmax = 145,83 pmol / mg Protein x Minute ) wie auch bei der ATP-unabhängigen Aufnahme (Km = 264,94 µM, vmax = 1322,69 pmol / mg Protein x Minute ) beobachtet. Diese ATP-unabhängige Aufnahme wurde in der vorliegendenStudie nicht weiter charakterisiert. Die ATP-abhängige Valsartan-Aufnahme ist temperaturabhängig. Eine nicht signifikante Vesikel-assoziierte [14C]-Valsartan-Aufnahmekonnte bei einer Temperatur von 7 °C festgestellt werden. Wurde die Temperatur von 7 °C auf 17 °C, 27 °C und 37 °C erhöht, so nahmauch die ATP-abhängige Aufnahme von [14C]-Valsartan zu. Q10-Werte zwischen 1,4 und 7 sprechen für einen transmembranärenTransport. Nach Transformation der Daten in Anlehnung an Arrhenius konnte eine scheinbare Aktivierungsenergie von 67,342 kJ / molermittelt werden. Darüber hinaus wurde die ATP-abhängige Aufnahme von [14C]-Valsartan durch den pH-Wert und die Osmolarität des Inkubationsmediumsbeeinflusst. Durch Transformation der Daten in einen Osmoplot konnte die unspezifische Bindung von [14C]-Valsartan an die Membranenermittelt werden. GSSG, Pravastatin und BSP, typische Substrate des kanalikulären multispezifischen Anionen- Transporters Mrp2 / cMoat, sind potentielleInhibitoren des Transportes von [14C]-Valsartan. Auch Leukotriene C4, das Substrat mit der höchsten Affinität, hemmte die ATP-abhängigeAufnahme von [14C]-Valsartan kompetitiv. Doch weder Taurocholat und Cholat, Substrate des kanalikulären Gallensäuretransporters, nochDaunomycin und Verapamil, Substrate des P-Glykoproteins ( Mdr1 ), zeigten einen hemmenden Effekt. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonist Valsartan über die Galle durch das kanalikuläremultispezifische organische Anionen Transportsystem Mrp2 / cMoat eliminiert wird, und dass darüber hinaus ein zweites ATP-abhängigesTransportsystem beteiligt ist, aller Wahrscheinlichkeit nach eines der neuen Mitglieder der Mrp-Familie. The molecular mechanisms of the biliary elimination of the angiotensin-II-receptor-antagonist Valsartan were investigated in vivo and inisolated canalicular membrane vesicles from normal Wistar-rat and transport-deficient TR-rat liver. After intravenous application of [14C]-Valsartan ( 1 mg / kg ) into a mesenteric vein the radioactive compound was rapidly eliminated intobile of normal Wistar-rats. Three hours after application 81 % of the compound could be detected in bile. In contrast, in TR--rats, defective inthe canalicular transport of organic anions ( absence of the transport system Mrp2 / cMoat ), [14C]-Valsartan was predominantly found inblood, only 39 % were excreted with the bile. In isolated canalicular plasma membrane vesicles from normal Wistar-rats [14C]-Valsartan was taken up in an ATP-dependent manner. This ATP-dependent part of the transport was diminished to 50 % in isolated plasma membrane vesicles from TR-rats. This points to thefact that Valsartan is a substrate of the canalicular multispecific organic anion transporter cMoat / Mrp2 and of another ATP-dependenttransporter that is also expressed in TR-rats. The ATP-dependent transport of [14C]-Valsartan into isolated canalicular plasma membranevesicles from normal Wistar-rats increased to the point of saturation when the Valsartan concentration was 57 µM and the ATPconcentration was increased from 0,5 to 3,0 mM ( Km ( ATP ) = 1,449 mM, vmax ( ATP ) = 62,22 pmol / mg protein x minute ). ATP in thepresence or absence of an ATP-regenerating system was most effective for Valsartan uptake among the several nucleotides studied. Thenonhydrolyzable analogues ( AMP, Adenosin, AMP-PCP ) could not stimulate the uptake significantly. Transport kinetic studies were performed over a wide range of Valsartan concentration ( 10 - 500 µM ). Saturation was observed both inthe ATP-dependent ( Km = 65,91 µM, vmax = 145,83 pmol / mg protein x minute ) and ATP-independent ( Km = 264,94 µM, vmax = 1322,69pmol / mg protein x minute ) uptake. This ATP-independent uptake was not further characterized in this study presented. The ATP-dependent uptake of Valsartan was temperature dependent. There was little increase in vesicle-associated [14C]-Valsartanuptake by 7 °C. Increasing the temperature from 7 °C to 17 °C, 27 °C and 37 °C increased the ATP-dependent uptake of [14C]-Valsartan.Q10 values between 1,4 and 7 indicate transmembrane transport. By transforming the data to Arrhenius, an apparent activation energy of67,342 kJ / pmol was determined. Futhermore the ATP-dependent uptake of [14C]-Valsartan was influenced by the pH value and the osmolarity of the incubation medium. Bytransforming the data to an osmoplot the non-specific binding of [14C]-Valsartan to the membranes could be determined. GSSG, Pravastatin and BSP, typical substrates of the canalicular multispecific anion trans-porter Mrp2 / cMoat, are potent inhibitors of[14C]-Valsartan transport. Leukotriene C4, the substrate with the highest affinity, competitively inhibited the ATP-dependent transport of[14C]-Valsartan. In contrast taurocholate and cholate, substrates of the canalicular bile salt transporter cBST, as well as Daunomycin andVerapamil, substrates of the P-glycoprotein ( Mdr1 ), did not inhibit Valsartan transport. These results indicate that the angiotensin-II-receptor-antagonist Valsartan is eliminated via the bile by the canalicular multispecific organicanion transporter Mrp2 / cMoat, and that an additional ATP-dependent transport system is involved, in all probability one of the recentlyidentified members of the Mrp family.