Untersuchung der Lokalisation und Interaktion von Caveolinen im Endothel und Atemwegsepithel mittels indirekter Immunfluoreszenz und CLSM-FRET-Analyse

Abstract

Caveolae sind einerseits in den Prozess der Transzytose und in verschiedene Signaltransduktionswege involviert, können aber auch als Eintrittspforte für Krankheitserreger dienen. Caveolin (Cav)-1 und -2 sowie die als muskelspezifisch geltende Isoform Cav-3 sind die Strukturproteine von Caveolae, wobei biochemische Untersuchungen eine direkte Interaktion von Cav-1 und Cav-2 nahe legen. Obwohl im Atemwegsepithel viele Signalproteine vorkommen, wie IP3-Rezeptoren und eNOS, die in ihrer Funktion durch Caveoline reguliert werden können, ist das Vorkommen von Cav-Isoformen und von Caveolae im Atemwegsepithel bisher nicht bekannt. Daher haben wir die Expression der mRNA und der Proteine aller drei Cav-Isoformen mittels RT-PCR und Western Blot untersucht und deren Lokalisation im Tracheal- und Bronchialepithel mittels Immunhistochemie bestimmt. Das Vorkommen von Caveolae wurde auch ultrastrukturell untersucht. Um eine enge räumliche Assoziation zwischen Cav-1alpha und Cav-2 in einzenen Zellen in Gewebeschnitten nachzuweisen, wurde eine neue Technik etabliert. Diese basiert auf indirekter Doppelimmunfluoreszenz mit nachfolgender Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse im CLSM. Diese Methode wurde zunächst am Endothel etabliert und nachfolgend zur Detektion der Assoziation von Cav-1 und -2 im Epithel eingesetzt. Der statistische Vergleich von FRETeff und deltaIF zeigte deutlich, dass deltaIF viel sensitiver und spezifischer zwischen Versuchs- und Kontrollbedingungen diskriminiert. Im Prinzip sind weder die Wahl des sekundären Reagenzes noch der Applikationsmodus entscheidend für das FRET-Ergebnis. Entscheidend sind die Spezifität der Antikörper und eine kontrollierte Stabilität des Messsystems. Diese Technik bietet die Möglichkeit, Einblicke in Protein-Protein-Interaktionen in Gewebeschnitten von normalem sowie auch pathologisch verändertem Gewebe zu gewinnen, einschließlich der Untersuchung von humanen Proben, die durch chirurgische Eingriffe erlangt und über Jahre archiviert wurden. Protein und mRNA für alle drei Cav-Isoformen wurden im abgeschabtem Trachealepithel und in der Lunge detektiert. Immunhistochemisch wurden Cav-1 und Cav-2 in den Basalzellen und alle drei Cav-Isoformen in den zilientragenden Zellen der großen Atemwege nachgewiesen. Cav-1alpha- und Cav-2-Immunreaktivität waren in den zilientragenden Zellen an der basolateralen Plasmamembran kolokalisiert, wo auch ultrastrukturell Caveolae gefunden wurden. Cav-3-Immunreaktivität fand sich in diesen Zellen dagegen apikal, kolokalisiert mit eNOS und CHT1. Diese Proteine sind in der Regulation der Zilienschlagfrequenz beteiligt. Hier waren ultrastrukturell keine Caveolae nachweisbar, hingegen fand sich unter den Basalkörperchen der Zilien ein tubulovesikuläres Netzwerk, das sich in engem Kontakt mit den Mitochondrien befand. In Cav-1-defizienten Mäusen fanden sich im Epithel weder Cav-1alpha-Immunreaktivität noch Caveolae, wobei in Wildtyp-Mäusen Cav-1alpha und Caveolae in den Basalzellen vorhanden waren. Im Gegensatz zur Ratte besaßen die zilientragenden Zellen der Maus weder Cav-1alpha-Immunreaktivität noch Caveolae. Mittels FRET-CLSM-Analyse konnten wir auf Einzelzellebene im Atemwegsepithel der Ratte eine Assoziation von Cav-1alpha und Cav-2 nachweisen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Caveolae und alle Cav-Isoformen in Bronchial- und Trachealepithel vorhanden sind, wobei eine direkte Interaktion von Cav-1alpha und Cav-2 angenommen werden kann. Die Ergebnisse weisen auf Funktionen aller drei Cav-Isoformen in Signaltransduktionswegen des Atemwegsepithels hin. Im apikalen Bereich der zilientragenden Zellen befindet sich ein tubulovesikuläres Kompartiment, das durch Cav-3 organisiert und in der Regulation der Zilienschlagfrequenz involviert sein könnte. Cav-1 und Cav-2 führen zur Bildung von Caveolae in Basalzellen und zilientragenden Zellen. Eine weitere Aufklärung der Funktion von Cav-1, -2 und -3 im Atemwegsepithel in situ ist besonders im Hinblick auf die in dieser Arbeit gefundene neue Lokalisation der Caveoline wichtig. Die Grundlagen hierfür konnten durch die hier vorliegende Arbeit geschaffen werden. Caveolae are involved in diverse cellular functions such as transcytosis and signal transduction, and on the other hand they also may serve as entry sites for microorganisms. Caveolin (cav)-1 and -2 as well as the cav-3 isoform that is generally believed to be muscle specific are stucture proteins of caveolae. Biochemical studies suggest a direct interaction between cav-1 and cav-2. Several proteins involved in signal transduction such as IP3 receptors and eNOS that are regulated in their function by caveolins are present in the airway epithelium. Hence, their occurrence in the epithelium of the airways might be expected but, nonetheless, has not yet been examined. Western blotting, real-time quantitative PCR analysis of abraded tracheal epithelium and laser-assisted microdetection combined with subsequent mRNA analysis were used to examine the expression of the cav isoforms in rat tracheal epithelium. Fluorescence immunohistochemistry was performed to locate cav-1, -2 and -3 in the airway epithelium. Electron-microscopic analyses were used for identification of caveolae. To identify the association of cav-1 and cav-2 in single cells in tissue, we established a new method. It is based on indirect double-labeling immunofluorescence combined with conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) to measure fluorescence resonance energy transfer (FRET). The interaction of cav-1 and cav-2 was at first examined in vascular endothelial cell in fixed tissue of rats and human glomus tumors. Subsequently , this technique was applied for detection of the interaction of both proteins in the epithelium. Several methodological aspects were examined. Statistical comparison of FRETeff and deltaIF clearly shows that deltaIF is more sensitive and more specific to discriminate control from experimental conditions. In principle, neither the choice of the secondary reagents nor the mode of application is a major determinant of success. Determining factors are the specificity of the antibodies and the stability of the imaging system. The method opens up the possibility to gain insight into protein-protein interactions in tissue sections in normal as well as in human material derived from surgical procedures and stored for extended times. Protein and mRNA for all three cav isoforms were detected in abraded tracheal epithelial cells and in the lung. Immunoreactivities for cav-1 and -2 were observed in the basal cells, and for all three cav isoforms in the ciliated cells of the large airways. Cav-1 and cav-2 were colocalized in the basal cells and at the baso-lateral plasma membrane of the ciliated cells, where ultrastructurally caveolae were found. Cav-3-immunolabeling was confined to the apical region of the ciliated cells and was colocalized with eNOS- and CHT-1-immunoreactivity. These proteins are involved in the regulation of the ciliary beat frequency. No caveolae were found in the apical plasma membrane of ciliated cells by electron microscopy but a tubulovesicular network was present in the apical region that reached up to the basal bodies of the cilia and was in contact with mitochondria. In contrast to human and rat, cav-1-immunoreactivity and caveolae were confined to basal cells in mice. Epithelial caveolae were absent in cav-1-deficient mice, implicating a requirement of this caveolar protein in epithelial caveolae formation. The ciliated cells of mice were devoid of cav-1-immunoreactivity and caveolae. Using conventional double-labeling immunofluorescence combined with CLSM-FRET analysis, we detected an association of cav-1alpha and cav-2 in epithelial cells. These results show that caveolae and all three cav isoforms are present in the bronchial and tracheal epithelium where a direct interaction between cav-1 and cav-2 can be assumed. The findings of this work point towards a role of all three cav isoforms in signal transduction pathways in airway epithelium. A specialized subplasmalemmal tubulovesicular compartiment was found to be localized in the apical region of the ciliated cells that might be organized from cav-3 and be involved in the regulation of the ciliary beat frequency. Cav-1 and cav-2 lead to formation of caveolae in basal and in ciliated cells. In the face of this newly recognized localisation of caveolins further investigations for defining the function of cav-1, -2 and -3 in airway epithelium in situ will be required. The present work provides the basic knowlidge and a starting point for this line of research.