Untersuchungen zur Phylogenese von Shigatoxin-bildenden Escherichia Coli der Serogruppe 0118

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden 89 Shigatoxin-bildende Escherichia coli (STEC)-, vier Enterotoxische Escherichia coli (ETEC)- undsieben nicht-STEC/nicht-ETEC-Stämme der Serogruppe O118 phäno- und genotypisch auf den Grad ihrer Verwandtschaft untersucht. Vonden 100 Stämmen waren 29 von Menschen, 65 von Rindern, fünf von Schweinen und ein Isolat von einer Ziege isoliert worden. AlleStämme wurden serotypisiert und mittels DNS-DNS-Hybridisierung sowie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf die Virulenzmerkmale stx(Shigatoxin-Allele), eae (Intimin-Gen) und espP (Gen für die Serinprotease EspP) untersucht. Der Nachweis des Hämolysins HlyEHECerfolgte im modifizierten Kulturverfahren unter Verwendung von Waschblutagar. Die genomische DNS der Stämme wurde einerMakrorestriktions-analyse mit den beiden Restriktionsendonukleasen BlnI und XbaI unterzogen. Die Ähnlichkeit der erzeugtenBandenmuster wurde mit Hilfe der 'unweighted pair group method analysis ' (UPGMA) mit arithmetischen Mitteln quantifiziert.Darüberhinaus wurden ausgewählte Stämme mit den Methoden der PCR, der Anzucht in Hitchens-Agar sowie der Elektronenmikroskopieauf das Vorhandensein des Strukturgens für das Geißelschaftprotein fliC bzw. die Expression und Funktion der Bakteriengeißel untersucht. Wie die Untersuchungen ergab, ließen sich die O118-Stämme anhand von ihren H-Antigentypen (9, 12, 16, 30, NM) fünf verschiedenenSerovaren zuordnen. 90,8 % (59/65) aller Rinderstämme verfügten wenigstens über die drei Virulenzmerkmale stx, HlyEHEC und eae. DieKombination aller vier untersuchten Virulenzmerkmale (stx, HlyEHEC, eae und espP) kam aber deutlich häufiger bei den bovinen (54/63;85,7 %) als bei den humanen (16/25; 64,0 %) STEC-Stämmen vor. In den durch Makrorestriktion erzeugten Bandenmustern stimmten dieverschiedenen O118-Stämme zwischen 40 und 100 % überein. Aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Makrorestriktionsprofile ließen sich sowohldie Stämme von Tieren als auch die Stämme von Menschen in drei Cluster einteilen (BlnI: AT, BT, CT bzw. AM, BM, CM, XbaI: DT, ET, FTbzw. DM, EM, FM). Diese Gruppierung war weitestgehend deckungsgleich mit der Gruppierung anhand der H-Antigentypen und korrelierte mit demVorhandensein eines stx-Gens, der Wirtsspezies sowie dem Herkunftsland der Stämme. O118-Stämme mit den H-Antigenen 30 und 12bildeten jeweils eine eigene, abgrenzbare Gruppe, besaßen ein Stx-Gen und stammten ausschließlich von Menschen. Eine weitere Gruppeumfaßte alle O118-Stämme mit dem H-Antigen 9. Diese besaßen kein Toxingen und stammten alle von Schweinen. Stämme der SerovareO118:H16 und O118:NM bildeten eine große, genetisch heterogene STEC-Gruppe, innerhalb der der Verwandtschaftsgrad derMakrorestriktionsprofile weder mit dem H-Antigentyp noch der Wirtsspezies (Mensch, Rind, Ziege) oder der geographischen Herkunftkorrelierte. Besonders hervorzuheben war der Fall eines 2-jährigen Jungen in Bayern, der infolge einer Infektion mit einemEHEC-O118:H16-Stamm erkrankt war und der nachweislich Kontakt zu einem gesunden Kalb hatte, bei dem ebenfalls ein O118:H16Stamm isoliert werden konnte. Die beiden Stämme waren in allen getesteten Merkmalen völlig identisch. Bei der näheren Untersuchung von ausgewählten O118:H16- und O118:NM-Stämmen (n= 9) konnte das Gen für das Geißelprotein fliC beiallen Vertretern der beiden Serovare nachgewiesen werden. Ferner waren elektronenmikroskopisch bei all diesen Stämmen Geißelnsichtbar, die im Gegensatz zu denen der Serovare O118:H30 und O118:H12 deutlich kürzer waren. Im Hitchens-Agar waren aber nur dieO118:NM-Stämme unbeweglich. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß E.coli mit der O-Antigendeterminante 118 eine heterogene Gruppe genetisch verwandterErreger darstellen. Es lassen sich mindestens drei verschiedene klonale STEC-Linien erkennen, deren divergente Entwicklung mitMutationen in Genen der Geißelbildung und/oder -funktion einherging, wenn sie nicht sogar dadurch mit verursacht wurde. Die Ähnlichkeitder Makrorestriktionsprofile läßt einen gemeinsamen Vorfahren für die Stämme der beiden Serovare O118:H16 und O118:NM in derjüngeren Vergangenheit vermuten. Andererseits spricht die bei diesen Stämmen mangelnde Korrelation zwischen den Makrorestriktionsprofilen und den H-Typen gegen dieThese, daß beide Serovare sich in einem einfachen bidirektional-divergenten Prozeß voneinander fortentwickelt hätten. EineReservoirfunktion des Rindes konnte bislang nur für STEC der Serovare O118:H16 und O118:NM nachgewiesen werden. Die völligeÜbereinstimmung der beiden O118:H16-Isolate von einem Kind und einem Kalb auf demselben Bauernhof läßt auf eineErregerübertragung zwischen dem Kalb und dem Kind schließen und weist auf die besonders große Bedeutung dieses Serovars alsZoonoseerreger hin. In the present study clonal relationships were investigated in a worldwide collection of 100 Escherichia coli strains of serogroup O118comprising 89 strains of Shigatoxin-producing E.coli (STEC), 4 strains of enterotoxigenic E.coli (ETEC), and 7 non-STEC/ non-ETECstrains . A total of 29 strains from humans, 65 strains from cattle, 5 strains from pigs and one strain from a goat were compared byserotyping, virulence typing and macrorestriction analysis. All strains were tested for virulence-associated genes stx (Shigatoxin alleles),eae (Intimin gene), and espP (Serinprotease EspP gene) by DNA-DNA-hybridization and polymerase chain reaction (PCR). HlyEHEC wasdetected by bacterial culture on agar containing washed sheep erythrocytes. Macrorestriction analysis was performed utilizing a pulsedfield gel electrophoresis (PFGE) technique for the separation of genomic DNA restriction fragments generated with endonucleases BlnIand XbaI. The similarities between PFGE banding patterns were quantitated by the unweighted pair group method analysis (UPGMA)with arithmetic means. Selected strains were examined for the presence of the fliC gene (major structural protein of the flagella filament),the expression of the flagella, and the motility of the bacterial cells by PCR, bacterial culture in Hitchens agar and electron microscopy,respectively. The study revealed that E.coli strains of serogroup O118 belonged to five different serovars according to their H antigen determinants (9,12, 16, 30, NM). 90,8 % (59/65) of all cattle strains exhibited at least the three virulence traits stx, HlyEHEC and eae. However, thecombination of stx, HlyEHEC, eae, and espP was detected considerably more frequently in bovine strains (54/63; 85,7 %) than in humanSTEC strains (16/25; 64,0 %). The similarities of the PFGE banding patterns ranged between 40 and 100 %. Based on these similaritiesboth the animal strains and the human strains clustered into three groups each (BlnI: AT, BT, CT bzw. AM, BM, CM, XbaI: DT, ET, FT bzw.DM, EM, FM, respectively). This clustering was almost identical with the classification of strains by their H antigens. Furthermore, the clustering also correlated well withthe carriage of a stx gene and the source (host species, country) of the strains. O118 strains expressing the H30 antigen as well as thosestrains expressing H12 formed a distinct group each, harboured a stx allele and had been isolated from humans only. Another groupconsisted of O118:H9 non-STEC/non-ETEC strains only and all of these were porcine strains. Based on their macrorestriction profiles theO118:H16 and O118:NM strains clustered into a distinct, large, but genetically heterogeneous STEC group of strains from humans, cattle,and goat. However, within this group macrorestricion profile typing, serotyping and the host (human, cattle, goat) or geographical origins didnot correlate. The case of a two-year-old boy in Bavaria, Germany, was of particular interest, because he suffered from diarrhea and provedinfected with a O118:H16 EHEC strain. He lived on a farm and had had contact to a healthy calf from which an O118:H16 strain had beenisolated as well. Both isolates were completely identical in all tests applied. The examination of selected strains of serovars O118:H16 and O116:NM (n= 9) revealed that the fliC gene was constantly present in bothserovars. Furthermore, flagella-like structures were detected in both serovars by electron microscopy. However, these structures weremarkedly shorter than those observed in strains of O118:H12 and O118:H30. In contrast to all other strains tested, strains of O116:NM weregenerally non motile. These results suggest that E.coli carrying the O118 determinant represent a heterogeneous but related group of pathogens whosedivergent evolution has been accompanied if not been causatively driven by mutations in genes responsible for flagella expression and/orfunction. This group includes at least three distinct clonal lineages of STEC represented by O118:H12, O118:H30, and O118:H16/NMstrains. The similarities between their macrorestriction profiles suggest that strains of serovars O118:H16 and O118:NM have a commonancestor. However, these profiles also contradict the hypothesis that both serovars have separated in a simple bidirectional-divergent process. In thepresent study, bovins have been identified as reservoires for STECS of serovars O118:H16 and O118:NM only. The finding of twocompletely identical O118:H16 STEC strains in a child and a calf on the same farm supports the idea that this STEC serovar is animportant zoonotic pathogen.